Chromosomal transformation in Saccharomyces cerevisiae with DNA isolated by pulse field gel electrophoresis.

Σκοπός: Η ανάδειξη της κλινικής σημασίας αποικισμού του ορθού με στελέχη Klebsiella pneumoniae ανθεκτικών στις καρβαπενέμες (CRKP), με την εφαρμογή μοριακών μεθόδων στα στελέχη CRKP που απομονώθηκαν από το ορθό και το αίμα ασθενών της Μονάδας Εντατικής Θεραπείας.Υλικό – μέθοδοι: Πρόκειται για προοπτική μελέτη η οποία διεξήχθη στο Γ.Ν.Θ. «Γ.ΓΕΝΝΗΜΑΤΑΣ» κατά την διάρκεια μιας τριετίας (2011-2014). Το υλικό αποτέλεσαν 498 ασθενείς οι οποίοι νοσηλεύτηκαν το συγκεκριμένο διάστημα στην Μονάδα Εντατικής Θεραπείας. Διενεργήθηκε μονοπαραγοντική και πολυπαραγοντική ανάλυση πιθανών παραγόντων κινδύνου αποικισμού και επακόλουθης σηψαιμίας με CRKP στελέχη. Η συλλογή των επιχρισμάτων ορθού γίνονταν την ημέρα εισαγωγής και στη συνέχεια δύο φορές την εβδομάδα μέχρι την έξοδό του ασθενούς απ΄ την Μ.Ε.Θ (Θάνατος ή μεταφορά σε άλλη κλινική). Καλλιέργειες αίματος λαμβάνονταν από τους ασθενείς με κλινική υποψία σηψαιμίας σε φιαλίδια BACTEC Plus Aerobic/F, Plus Anaerobic/F and Mycosis IC/F,τα οποία επωάζονταν στο αυτοματοποιημένο σύστημα BACTEC 9120 (BD Diagnostic Systems, Sparks, MD, USA). Στα δείγματα ορθού γίνονταν έλεγχος για την ύπαρξη CRKP, με επίστρωση των δειγμάτων σε χρωμοάγαρ (chromIDCARBAprototypemedium –bioMérieux). Η ταυτοποίηση κι ο έλεγχος ευαισθησίας στους αντιμικροβιακούς παράγοντες των στελεχών CRKP ορθού και αίματος έγινε με το αυτοματοποιημένο σύστημα VITEK 2 (bioMerieux, Marcy l'Etoile, France). Σε όλα τα υποτιθέμενα απομονωμένα στελέχη CRKP, οι καρβαπενεμάσες ανιχνεύθηκαν με φαινοτυπικά τεστ (φαινυλοβορονικό οξύ και EDTA) και επιβεβαιώθηκαν με μοριακές τεχνικές PCR για γονίδια KPC, IMP και VIM, NDM και ΟΧΑ-48. Η γενετική συγγένεια στελεχών ορθού και αίματος ελέγχθηκε με ηλεκτροφόρηση παλλόμενου ηλεκτρικού πεδίου (PFGE-pulse-field gel electrophoresis) και MLST(multilocussequencetyping). Αποτελέσματα: Από το σύνολο των ασθενών, 226 αποικίστηκαν στο ορθό με στελέχη CRKP,48 από τους οποίους ανέπτυξαν σηψαιμία από αντίστοιχα στελέχη. Η διάρκεια παραμονής στη ΜΕΘ, η αναλογία ασθενών/νοσηλευτή και η προηγούμενη χρήση αντιμικροβιακών παραγόντων με αντιαναερόβια δράση, συσχετίστηκαν με τον αποικισμό οθού.Κανένας συγκεκριμένος παράγοντας δεν συσχετίστηκε με την επακόλουθη εμφάνιση σηψαιμίας.Το γονίδιο blaKPC-2 ανιχνεύθηκε σε όλα τα εξεταζόμενα στελέχη (48 ορθού και 48 αίματος) και όλα ανήκαν στον κλώνο ST-258. Με βάση τα αποτελέσματα της ηλεκτροφόρησης, τα στελέχη του αίματος ήταν γενετικά όμοια με τα αντίστοιχα του ορθού για κάθε ασθενή. Συμπεράσματα: Η μελέτη υποστηρίζει την ισχυρή συσχέτιση μεταξύ αποικισμού και σηψαιμίας, δεδομένου ότι 48 ασθενείς εμφάνισαν λοίμωξη με τα ίδια στελέχη CRKP που είχαν αποικιστεί. Ο περιορισμός της χορήγησης αντιμικροβιακών παραγόντων με αντιαναερόβια δράση, η μείωση της διάρκειας παραμονής στην ΜΕΘ και η διατήρηση ενός χαμηλού λόγου ασθενών/νοσηλευτή, είναι πιθανές στρατηγικές για τον περιορισμό του αποικισμού του ορθού με CRKP στελέχη και την μείωση της διασποράς των στελεχών αυτών.

Download Full-text

In vivo selection of porin-deficient mutants of Klebsiella pneumoniae with increased resistance to cefoxitin and expanded-spectrum-cephalosporins.

Antimicrobial Agents and Chemotherapy ◽

10.1128/aac.40.2.342 ◽

1996 ◽

Vol 40 (2) ◽

pp. 342-348 ◽

Cited By ~ 135

Author(s):

L Martínez-Martínez ◽

S Hernández-Allés ◽

S Albertí ◽

J M Tomás ◽

V J Benedi ◽

...

Keyword(s):

Klebsiella Pneumoniae ◽

Gel Electrophoresis ◽

Dna Analysis ◽

Pulse Field ◽

Transfer Resistance ◽

Beta Lactamases ◽

Pulse Field Gel Electrophoresis ◽

Gene Coding ◽

Selection Of

Four Klebsiella pneumoniae isolates (LB1, LB2, LB3, and LB4) with increased antimicrobial resistance were obtained from the same patient. The four isolates were indistinguishable in biotype, plasmid content, lipopolysaccharide, and DNA analysis by pulse-field gel electrophoresis. Isolate LB1 made TEM-1 and SHV-1 beta-lactamases. Isolates LB2, LB3, and LB4 produced SHV-5 in addition to TEM-1 and SHV-1. MICs of cefoxitin, ceftazidime, and cefotaxime against LB1 were 4, 1, and 0.06 micrograms/ml, respectively. MICs of ceftazidime against K. pneumoniae LB2, LB3, and LB4 were > 256 micrograms/ml, and those of cefotaxime were 2, 4, and 64 micrograms/ml, respectively. MICs of cefoxitin against K. pneumoniae LB2 and LB3 were 4 micrograms/ml, but that against K. pneumoniae LB4 was 128 micrgrams/ml. K. pneumoniae LB4 could transfer resistance to ceftazidime and cefotaxime, but not that to cefoxitin, to Escherichia coli. Isolate LB4 and cefoxitin-resistant laboratory mutants lacked an outer membrane protein of about 35 kDa whose molecular mass, mode of isolation, resistance to proteases, and reaction with a porin-specific antiserum suggested that it was a porin. MICs of cefoxitin and cefotaxime reverted to 4 and 2 micrograms/ml, respectively, when isolate LB4 was transformed with a gene coding for the K. pneumoniae porin OmpK36. We conclude that the increased resistance to cefoxitin and expanded-spectrum cephalosporins of isolate LB4 was due to loss of a porin channel for antibiotic uptake.

Download Full-text

Genotypic Characterization of Coagulase-negative Staphylococci Isolated from Sheep Milk in Slovakia

Acta Veterinaria Brno ◽

10.2754/avb201079020269 ◽

2010 ◽

Vol 79 (2) ◽

pp. 269-275 ◽

Cited By ~ 6

Author(s):

Ivana Pilipčincová ◽

Mangesh Bhide ◽

Eva Dudriková ◽

Milan Trávniček

Keyword(s):

Molecular Characterization ◽

Gel Electrophoresis ◽

Biochemical Characterization ◽

Pulse Field ◽

Coagulase Negative Staphylococci ◽

Pulse Field Gel Electrophoresis ◽

Milk Samples ◽

Sheep Milk ◽

Epidemiological Situation

Hitherto very few reports are available presenting identification and molecular characterization of the coagulase negative staphylococci (CNS) from sheep milk in the subclinical stage of mastitis. Furthermore, very scanty data are available on the epidemiological status of CNS in different Slovak provinces. Milk samples from 54 sheep farms located in eastern Slovak region were screened. A total 240 CNS were identified with series of biochemical testes (STAPH-API) and subjected further for genotyping with the help of pulse field gel electrophoresis (PFGE). The most frequently occurring CNS species according the biochemical characterization were:S. epidermidis(36.3 %),S. caprae(21.3 %),S. hominis(6.6 %),S. chromogenes(6.3 %),S. xylosus(5.8 %),S. warneri(5.0 %) andS. capitis(4.6 %). Further PFGE-based characterization of these isolates revealed six pulsotypes of theS. epidermidis, two ofS. caprae, three ofS. chromogenes, nine ofS. hominis, five ofS. capitisand seven ofS. xylosus. These results contribute to knowledge of the epidemiological situation of the CNS from the subclinical form of mastitis in Slovakia.

Download Full-text