Η διεγερσιτοξικότητα είναι μια άμεση συνέπεια της αμφιβληστροειδικής ισχαιμίας η οποία μπορεί να οδηγήσει στην ανάπτυξη σοβαρών αμφιβληστροειδοπαθειών όπως είναι η διαβητική αμφιβληστροειδοπάθεια και η γεροντική εκφύλιση της ωχράς κηλίδας (Lipton και Rosenberg, 1994˙ Campochiaro, 2000˙ Osborne και συν., 2004˙ Grant και συν., 2005). Οι θεραπείες που χρησιμοποιούνται σήμερα για τις ισχαιμικές αμφιβληστροειδοπάθειες περιλαμβάνουν θεραπείες με laser αλλά και φαρμακολογικές προσεγγίσεις που στοχεύουν στην καταπολέμηση της νεοαγγείωσης αλλά όχι και του κυτταρικού θανάτου που παρατηρείται κατά τις ισχαιμικές αμφιβληστροειδοπάθειες. Για τη διατήρηση της όρασης είναι επιτακτική η ανάγκη εύρεσης νέων θεραπευτικών στόχων, που σε συνδυασμό με τις ήδη εφαρμοζόμενες θεραπείες θα μπορούσαν να οδηγήσουν στη δημιουργία πιο αποτελεσματικών θεραπευτικών σχημάτων. Στόχος της παρούσας διατριβής ήταν η διερεύνηση των νευροπροστατευτικών δράσεων των ενδογενών [2-αραχιδονοϋλαιθανολαμίνη (2-arachidonoylethanolamine, ΑΕΑ, anandamide, ανανδαμίδιο) και 2-αραχιδονοϋλγλυκερόλη (2-arachidonoylglycerol, 2-AG)], συνθετικών κανναβινοειδών (MethAEA και HU-210), καθώς και των αναστολέων των ενζύμων μεταβολισμού των ενδοκανναβινοειδών, έναντι του κυτταρικού θανάτου, σε ένα in vivo μοντέλο AMPA διεγερσιτοξικότητας σε αμφιβληστροειδή τρωκτικών, καθώς και των μηχανισμών που εμπλέκονται σε αυτές τις δράσεις. Χρησιμοποιήθηκε το in vivo μοντέλο της AMPA διεγερσιτοξικότητας (Kiagiadaki και Thermos, 2008) στον αμφιβληστροειδή επίμυος και μελετήθηκαν οι νευροπροστατευτικές δράσεις των συνθετικών HU-210 και MethAEA καθώς και των ενδογενών κανναβινοειδών AEA και 2-AG. Τα κανναβινοειδή συν-χορηγήθηκαν ενδοϋαλοειδικά μαζί με AMPA, εικοσιτέσσερις (24) ώρες μετά τη χορήγηση του AMPA τα ζώα θανατώθηκαν και οι αμφιβληστροειδείς τους προετοιμάστηκαν για ανοσοϊστοχημικές μελέτες ή μελέτες ανοσοαποτύπωσης. Το AMPA προκάλεσε ραγδαία μείωση των χολινεργικών και bNOS ανοσοδραστικών κυττάρων συγκριτικά με τους ιστούς ελέγχου, ενώ τα κανναβινοειδή παρείχαν νευροπροστασία έναντι της AMPA διεγερσιτοξικότητας, αυξάνοντας στατιστικώς σημαντικά τoν αριθμό των παραπάνω κυττάρων συγκριτικά με τους ιστούς που έλαβαν AMPA. Οι νευροτοξικές δράσεις του AMPA και οι νευροπροστατευτικές δράσεις των κανναβινοειδών επιβεβαιώθηκαν με τη χρήση της χρώσης TUNEL. Περαιτέρω μελέτες έδειξαν ότι ο κυτταρικός θάνατος που παρατηρήθηκε ήταν ανεξάρτητος της ενεργοποίησης της κασπάσης-3. Για τη μελέτη της εμπλοκής των CB1 και CB2 υποδοχέων στις νευροπροστατευτικές δράσεις των κανναβινοειδών χρησιμοποιήθηκε μια σειρά από διαφορετικές προσεγγίσεις (χρήση ανταγωνιστών των CB1 και CB2 υποδοχέων, μελέτες δέσμευσης, μελέτες της νευροπροστατευτικής δράσης του CB2 αγωνιστή JWH015, μελέτες RT-PCR αλλά και μελέτες σε CB1-/- και CB2-/- μύες), τα αποτελέσματα των οποίων μας οδήγησαν στην υπόθεση ότι ο CB1 αλλά όχι ο CB2 υποδοχέας εμπλέκεται στη νευροπροστασία που παρατηρήθηκε στην παρούσα μελέτη.Μελετήθηκε επίσης η εμπλοκή του TRPV1 υποδοχέα των βανιλλοειδών στις νευροπροστατευτικές δράσεις των κανναβινοειδών με χρήση του ανταγωνιστή (capsazepine) και του αγωνιστή (capsaicin) του TRPV1 υποδοχέα και φάνηκε ότι ο εν λόγω υποδοχέας δεν εμπλέκεται στις δράσεις των κανναβινοειδών που παρατηρούνται στην παρούσα μελέτη. Επόμενο βήμα ήταν η μελέτη της εμπλοκής των σηματοδοτικών μονοπατιών PI3K/Akt και MEK/ERK1/2 στις νευροπροστατευτικές δράσεις των κανναβινοειδών. Μελέτες ανοσοαποτύπωσης καθώς και η χρήση του PI3K/Akt αναστολέα wortmannin αλλά και διαγονιδιακών Akt2-/-μυών υποστήριξαν την εμπλοκή του PI3K/Akt ή/και MEK/ERK1/2 στις νευροπροστατευτικές δράσεις των κανναβινοειδών. Συγκεκριμένα το σηματοδοτικό μονοπάτι PI3K/Akt φαίνεται να εμπλέκεται στις δράσεις των ΑΕΑ, 2-AG και HU-210, ενώ το μονοπάτι MEK/ERK1/2 φαίνεται να εμπλέκεται στις δράσεις των ΑΕΑ, 2-AG, αλλά όχι του HU-210. Πέραν της εξωγενούς χορήγησης των ενδοκανναβινοειδών ΑΕΑ και 2-AG, έμμεσος τρόπος αύξησης των επιπέδων τους στη σύναψη είναι και η αναστολή της αποικοδόμησης τους μέσω αναστολέων των ενζύμων που ευθύνονται για τον καταβολισμό τους [υδρολάση των αμιδίων των λιπαρών οξέων (Fatty Acid Amide Hydrolase, FAAH) και λιπάσης της μονοακύλογλυκερόλης (MonoacylGlycerol Lipase, MGL)], αντίστοιχα. Στην παρούσα μελέτη ερευνήσαμε την πιθανή νευροπροστατευτική δράση του αναστολέα της FAAH (AM6642) και ενός διπλού αναστολέα των FAAH και MGL (AM9928), ως νέους θεραπευτικούς στόχους. Οι δύο αναστολείς συν-χορηγούμενοι με AMPA παρείχαν προστασία στον ιστό με τον ΑΜ9928 να δρα πιο αποτελεσματικά. Η νευροπροστατευτική δράση των δύο αναστολέων αναστάλθηκε παρουσία του CB1 ανταγωνιστή AM251. Για την περαιτέρω αύξηση των επιπέδων των κανναβινοειδών στη σύναψη συν-χορηγήθηκε AMPA με AM6642 ή AM9928 και HU-210, AEA, MethAEA ή 2-AG και μελετήθηκε η ενδεχόμενη νευροπροστατευτική τους δράση. H παρουσία εξωγενώς χορηγούμενων κανναβινοειδών αναίρεσε τη νευροπροστατευτική δράση των AM6642 και AM9928, με μοναδική εξαίρεση τη συν-χορήγηση AMPA + MethAEA + AM6642. Η μείωση που παρατηρήθηκε πιθανόν να οφείλεται σε μειο-ρύθμιση (down regulation) του CB1 υποδοχέα καθώς υπάρχουν δεδομένα που υποστηρίζουν την απευαισθητοποίησή του CB1 και μειορύθμιση του μετά από παρατεταμένη αναστολή του ενζύμου MGL (Schlosburg και συν., 2010). Το γεγονός ότι η MethAEA δε μείωσε τη νευροπροστατευτική δράση του ΑΜ6642 πιθανώς οφείλεται στο ότι η MethAEA είναι ένα μεταβολικά σταθερό μόριο που δεν καταβολίζεται από την FAAH (Abadji και συν., 1994). Το δεύτερο συνθετικό κανναβινοειδές που χρησιμοποιήθηκε (HU-210) συμπεριφέρθηκε μιμούμενο τα ενδογενή κανναβινοειδή και αναίρεσε τις νευροπροστατευτικές δράσεις των ΑΜ6642 και ΑΜ9928. Ωστόσο, δεδομένου ότι δεν υπάρχουν δεδομένα για τον μηχανισμό καταβολισμού του HU-210 δε μπορούμε να σχολιάσουμε τον τρόπο δράσης του HU-210 στη μείωση των νευροπροστατευτικών δράσεων των αναστολέων μεταβολισμού των ενδοκανναβινοειδών. Συμπερασματικά, τα αποτελέσματα της παρούσας διατριβής συνηγορούν υπέρ του νευροπροστατευτικού ρόλου του κανναβινοειδικού συστήματος έναντι της AMPA διεγερσιτοξικότητας στον αμφιβληστροειδή τρωκτικών. Τα κανναβινοειδή παρείχαν προστασία έναντι της AMPA διεγερσιτοξικότητας μέσω ενεργοποίησης του CB1 υποδοχέα και των σηματοδοτικών μονοπατιών PI3K/Akt ή/και ERK1/2. Η μελέτη της εμπλοκής αποπτωτικών μηχανισμών ανέδειξε ότι η ενεργοποίηση της κασπάσης-3 δεν εμπλέκεται στον κυτταρικό θάνατο που παρατηρείται μετά τη χορήγηση AMPA, γεγονός το οποίο απαιτεί περαιτέρω μελέτη. Η αναστολή των ενζύμων καταβολισμού των ενδοκανναβινοειδών φάνηκε εξίσου αποτελεσματική με την εξωγενή χορήγηση κανναβινοειδών στην παροχή νευροπροστασίας στον ιστό. Ωστόσο, παρουσία εξωγενώς χορηγούμενων κανναβινοειδών, οι αναστολείς των ενζύμων καταβολισμού των ενδοκανναβινοειδών δεν παρείχαν νευροπροστατευτική δράση, γεγονός το οποίο χρήζει περαιτέρω διερεύνησης.Τα ευρήματα της παρούσας μελέτης συνηγορούν υπέρ του ότι το κανναβινοειδικό σύστημα μπορεί να διαδραματίσει σημαντικό ρόλο στην φυσιολογία και παθοφυσιολογία του αμφιβληστροειδούς και αποτελεί έναν σημαντικό νευροπροστατευτικό στόχο για τη δημιουργία αποτελεσματικότερων σχημάτων που θα στοχεύουν στη θεραπεία σοβαρών αμφιβληστροειδοπαθειών.
A Second Generation of Carbamate-Based Fatty Acid Amide Hydrolase Inhibitors with Improved Activity in vivo
