Εισαγωγή: Οι σταφυλόκοκκοι συγκαταλέγονται μεταξύ των μικροοργανισμών που απομονώνονται συχνότερα στο Εργαστήριο Κλινικής Μικροβιολογίας. Εκτός από τον S. aureus, ένας αυξανόμενος αριθμός κοαγκουλάση αρνητικών ειδών, αναδεικνύονται τις τελευταίες δεκαετίες ως αίτια σημαντικών λοιμώξεων καθιστώντας επιτακτική την ορθή ταυτοποίηση του είδους.Σκοπός: Η παρούσα διδακτορική διατριβή εστιάσθηκε στη μελέτη της φαινοτυπικής και μοριακής ταυτοποίησης των κλινικά σημαντικότερων σταφυλοκοκκικών ειδών. Αξιολογήθηκε η απόδοση των, ευρέως διαδεδομένων, ταυτοποιητικών συστημάτων Vitek 2 (bioMérieux) και Phoenix (Becton Dickinson), συγκριτικά με πρότυπη μοριακή μεθοδολογία. Αναπτύχθηκαν μια απλή PCR για την αναγνώριση του S. lugdunensis, καθώς και μια πολυπλεκτική PCR για την ταυτόχρονη ανίχνευση οκτώ σημαντικών ειδών (S. aureus, S. epidermidis, S. hominis, S. haemolyticus, S. saprophyticus, S. lugdunensis, S. capitis και S. simulans) και τμήματος του mecA γονιδίου. Τέλος, μελετήθηκε εργαστηριακά και κλινικά το είδος S. lugdunensis, ως ο πλέον παθογόνος σταφυλόκοκκος μετά τον S. aureus.Υλικό: Χρησιμοποιήθηκαν 206 επιλεγμένα κλινικά στελέχη σταφυλοκόκκων των ειδών S. aureus, S. epidermidis, S. lugdunensis, S. haemolyticus, S. hominis, S. cohnii, S. saprophyticus, S. capitis, S. simulans και S. sciuri, τα οποία ταυτοποιήθηκαν με τις πρότυπες μεθόδους RFLP (restriction fragment length polymorphism) ανάλυσης του γονιδίου tuf ή και προσδιορισμού της αλληλουχίας του γονιδίου 16S rRNA, ενώ το γονίδιο mecA αναζητήθηκε με απλή PCR. Ως μάρτυρες συμπεριλήφθηκαν, 17 τυχαία επιλεγμένα κλινικά στελέχη άλλων γενών και 20 πρότυπα στελέχη.Μέθοδοι: Τα κλινικά στελέχη των σταφυλοκόκκων ταυτοποιήθηκαν φαινοτυπικά με τα συστήματα Vitek 2 και Phoenix. Για το τελευταίο δοκιμάστηκε και το νεότερο πρωτόκολλο του εναιωρήματος θολερότητας 0,25 McFarland. Η στατιστική σημαντικότητα των αποτελεσμάτων σύγκρισης των μεθόδων προσδιορίστηκε με τη δοκιμασία χ2. Αναπτύχθηκε πρωτόκολλο αναγνώρισης του S. lugdunensis με απλή PCR επιλέγοντας το γονίδιο fbl, και πρωτόκολλο πολυπλεκτικής αντίδρασης στοχεύοντας τα γονίδια femA (S. aureus και S. saprophyticus), fbl (S. lugdunensis), sodA (S. haemolyticus, S. capitis και S. simulans), ένα χρωμοσωμικό τμήμα άγνωστης κωδικής σημασίας (S. epidermidis), τμήμα του 16S rRNA (S. hominis) και το γονίδιο mecA (αντοχή στη μεθικιλλίνη). Για την απευθείας εφαρμογή της πολυπλεκτικής αντίδρασης σε φιάλες θετικών αιμοκαλλιεργειών δοκιμάστηκαν πέντε πρωτόκολλα απομόνωσης βακτηριακού γενετικού υλικού (έκπλυσης με αλκαλικό διάλυμα και θερμικής λύσης, έκπλυσης με απεσταγμένο νερό, έκπλυσης με BSA, οργανικής εκχύλισης με βενζυλική αλκοόλη και θειοκυανιούχο γουανιδίνη και το High Pure PCR Template Preparation Kit [Roche]). Τέλος, για τη μελέτη του είδους S. lugdunensis αναζητήθηκαν αναδρομικά τα στελέχη που είχαν απομονωθεί στη διάρκεια μιας τριετίας στο Εργαστήριο Κλινικής Μικροβιολογίας του Πανεπιστημιακού Γενικού Νοσοκομείου «ΑΤΤΙΚΟΝ». Μετά την οριστική ταυτοποίησή τους (προσδιορισμός αλληλουχίας 16S rRNA), τα στελέχη εξετάστηκαν με τα συστήματα Phoenix και API Staph (bioMérieux), καθώς και με απλές βιοχημικές δοκιμασίες, ελέγχθηκε η ευαισθησία τους, αναζητήθηκε η κλινική τους σημασία και προσδιορίστηκε η γενετική τους ποικιλομορφία (μέθοδος PFGE [pulsed-field gel electrophoresis]).Αποτελέσματα: Τα ποσοστά σωστής ταυτοποίησης για τον S. aureus, τον S. epidermidis και τα υπόλοιπα κοαγκουλάση αρνητικά είδη υπολογίστηκαν στο 100%, 100% και 93,3% για το Vitek 2, στο 100%, 86% και 82,2% για το καθιερωμένο πρωτόκολλο του Phoenix και στο 100%, 92% και 82,2% για το πρωτόκολλο του εναιωρήματος των 0,25 McFarland, αντίστοιχα. Αναφορικά με το σύνολο των κοαγκουλάση αρνητικών ειδών, το σύστημα Vitek 2 υπερείχε και των δύο πρωτοκόλλων του Phoenix (p=0,002 και p=0,007, αντίστοιχα), ενώ η σύγκριση των τελευταίων μεταξύ τους δεν ανέδειξε διαφορά (p=0,467). H PCR που σχεδιάστηκε για την αναγνώριση του S. lugdunensis ανίχνευσε το γονίδιο fbl μόνο στα στελέχη του είδους, ενώ και η πολυπλεκτική αντίδραση πολλαπλασίασε ειδικά τα αναμενόμενα προϊόντα από όλα τα κλινικά και πρότυπα στελέχη και προσδιόρισε ορθά την αντοχή τους στη μεθικιλλίνη. Η απευθείας εφαρμογή της πολυπλεκτικής PCR σε υλικό θετικών αιμοκαλλιεργειών κατέστη δυνατή μόνο με την οργανική μέθοδο εκχύλισης βακτηριακού DNA. Αναφορικά με τον S. lugdunensis, η ταυτοποίηση 14 στελεχών του είδους αποδείχθηκε προβληματική με το σύστημα Phoenix. Τα ποσοστά αντοχής στα αντιμικροβιακά δεν ξεπέρασαν το 21% για την πενικιλλίνη και το 7% για τη μεθικιλλίνη, τη γενταμικίνη και τις κινολόνες. Τουλάχιστον στα μισά περιστατικά ο S. lugdunensis συνδέθηκε με κλινικά σημαντικές λοιμώξεις, εκ των οποίων τα δύο περιστατικά ενδοκαρδίτιδας παρουσίασαν άριστη έκβαση. Η PFGE κατέδειξε χαμηλή γενετική ποικιλομορφία για το είδος. Συμπεράσματα: Η ορθή ταυτοποίηση των κοαγκουλάση αρνητικών σταφυλοκόκκων χρησιμοποιώντας τα αυτοματοποιημένα φαινοτυπικά συστήματα δεν είναι δεδομένη. Η κλινική εφαρμογή μοριακών τεχνικών ταυτοποίησης, όπως αυτές που αναπτύχθηκαν στην παρούσα μελέτη, αναμένεται να βελτιώσει την αναγνώριση του είδους των κοαγκουλάση αρνητικών σταφυλοκόκκων συμβάλλοντας στον ακριβέστερο προσδιορισμό του παθογενετικού τους ρόλου.
Optimization of Terminal-Restriction Fragment Length Polymorphism Analysis for Complex Marine Bacterioplankton Communities and Comparison with Denaturing Gradient Gel Electrophoresis
