Development and clinical application of methods for the molecular characterisation of circulating tumour cells (CTCs)
Η μοριακή ανάλυση των κυκλοφορούντων καρκινικών κυττάρων (circulating tumour cells, CTCs) και του κυκλοφορούντος καρκινικού DNA (circulating tumour DNA, ctDNA), της επονομαζόμενης «υγρής βιοψίας», παρέχει τη δυνατότητα παρακολούθησης της εξέλιξης ενός όγκου σε πραγματικό χρόνο. Η επιγενετική αποσιώπηση ογκοκατασταλτικών και κατασταλτικών της μετάστασης γονιδίων παίζει σημαντικό ρόλο για την επιβίωση και το μεταστατικό δυναμικό των καρκινικών κυττάρων. Σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν η ανάπτυξη και αξιολόγηση μεθόδων για το μοριακό χαρακτηρισμό των CTCs, βασισμένων στην τεχνολογία υγρής συστοιχίας σφαιριδίων και η εφαρμογή τους σε κλινικά δείγματα ασθενών με καρκίνο του μαστού. Στην παρούσα διατριβή αναπτύχθηκε και αξιολογήθηκε μεθοδολογία υγρής συστοιχίας σφαιριδίων σε συνδυασμό με πολλαπλή RT-PCR (multiplex PCR-coupled liquid bead array, MLBA) για την ταυτόχρονη μελέτη της έκφρασης των ακόλουθων 14 γονιδίων: ALDH1, CD24, CD44, CK19, HER2, hMAM, MAGEA3, PDCD4, PTEN, SNAIL, TWIST, VIM, και PBGD και HPRT ως γονίδια αναφοράς. Η MLBA χαρακτηρίστηκε από υψηλή αναλυτική ειδικότητα, ευαισθησία και αναπαραγωγιμότητα. Η MLBA επίσης συγκρίθηκε με μια εμπορικώς διαθέσιμη δοκιμασία (AdnaTest BreastCancer) και την πολλαπλή RT-qPCR πουαναπτύξαμε στο εργαστήριό μας. Η MLBA θα μπορούσε να επεκταθεί περαιτέρω σε μεγαλύτερο αριθμό γονιδίων-στόχων, π.χ. σε γονίδια που σχετίζονται με την ανταπόκριση στη θεραπεία.Επίσης, αναπτύχθηκε και αξιολογήθηκε μεθοδολογία υγρής συστοιχίας σφαιριδίων σε συνδυασμό μεπολλαπλή ειδική για τη μεθυλίωση PCR (multiplex methylation specific PCR-coupled liquid bead array, MMSPA) για την ταυτόχρονη ανίχνευση της μεθυλίωσης των υποκινητών τριών ογκοκατασταλτικών και κατασταλτικών της μετάστασης γονιδίων, CST6, SOX17 και BRMS1, σε δείγματα CTCs, ctDNA και των αντίστοιχων πρωτοπαθών όγκων ασθενών με καρκίνο του μαστού. Η MMSPA χαρακτηρίστηκε από υψηλή αναλυτική ειδικότητα, ευαισθησία και αναπαραγωγιμότητα. Η MSSPA επίσης συγκρίθηκε με τις qMSP που έχουν αναπτυχθεί στο εργαστήριό μας για τον υποκινητή κάθε γονιδίου. Η MMSPA θα μπορούσε να επεκταθεί και σε άλλα γονίδια-στόχους και να εφαρμοστεί και σε άλλους τύπους καρκίνου. Στο πλαίσιο της παρούσας διατριβής, έγινε επίσης προσπάθεια σύγκρισης της RT-qPCR που έχει αναπτυχθεί στο εργαστήριό μας για την ανίχνευση της CK19 και της τεχνικής EPISPOT, που βασίζεται στην ανίχνευση πρωτεΐνης. Οι δύο μέθοδοι έδωσαν παρόμοια αποτελέσματα αναφορικώς με τη θετικότητα των δειγμάτων αλλά δεν κατέστη δυνατή η σύγκρισή τους στο επίπεδο της απόλυτης ποσοτικοποίησης, καθώς αντιπροσωπεύουν διαφορετικές προσεγγίσεις. Μια πιο ουσιώδης σύγκριση των 2 μεθόδων θα ήταν η διερεύνηση της συσχέτισής τους ως προς τη θετικότητα δειγμάτων CTCs σε ασθενείς.