scholarly journals Identificación y caracterización de eventos de lectura de codones de parada a nivel genómico en Drosophila melanogaster

2021 ◽  
Author(s):  
◽  
Luciana Inés Escobar
Keyword(s):  
Drosophila Melanogaster ◽  
Expresión Génica ◽  
Nuevas Tecnologías

Para que las células funcionen correctamente, la información génica debe expresarse fielmente en ARN o proteínas. Un paso clave en la expresión génica es la traducción de ARNm a proteína, donde el reconocimiento de uno de los tres codones de parada (TAA, TGA o TAG) por la maquinaria traduccional es esencial para terminar la traducción en la posición correcta, y garantizar la función de la proteína sintetizada. Sin embargo, en determinadas ocasiones, los ribosomas pueden ignorar el codón de terminación y en cambio recodificarlo continuando la traducción en la región 3' UTR, incorporando aminoácidos hasta que la maquinaria ribosomal reconoce un codón de parada posterior. En consecuencia, se sintetizan nuevos productos polipeptídicos extendidos en su extremo C-terminal que pueden adquirir un nuevo dominio funcional. Esta ausencia de reconocimiento del codón de terminación se denomina lectura del codón de parada (denotado en adelante como LCP). Aunque existe evidencia de proteínas funcionales derivadas de eventos de LCP en diversos genomas, aún se desconocen ampliamente las condiciones que inducen este fenómeno. Por esta razón, se ha discutido la presunción de que la LCP puede constituir un error de decodificación en la traducción, debido a errores moleculares en un entorno regulador que conducen a la expresión de diferentes isoformas de proteínas. No obstante, recientes experimentos en eucariotas sugieren que los eventos de LCP son algo más generalizados de lo que se suponía previamente, y que podrían estar regulados. En este sentido, varios autores han propuesto que la LCP podría ocurrir por la acción programada de componentes moleculares específicos, aún no identificados; generando la hipótesis que la LCP es un mecanismo para ampliar la diversidad de los proteomas. Por otro lado, las nuevas tecnologías de secuenciación han puesto de manifiesto algunas dificultades del proceso de anotación genómica. En este sentido, se ha detectado una considerable cantidad de eventos de traducción en regiones previamente consideradas no codificantes, tanto en las extensiones de marcos de lectura por LCP, como en la traducción de pequeños marcos de lectura en los 5' UTRs. Muchos de estos péptidos no convencionales descubiertos conllevan estructuras génicas que aguardan clasificación, y cuestionan la anotación existente de muchos genes conocidos. Al respecto, una anotación eficiente requiere no sólo el registro de nuevos elementos funcionales, sino además corregir la delimitación imprecisa de muchos ORFs conocidos. En esta tesis se realizó una identificación exhaustiva de eventos de LCP en el transcriptoma de D. melanogaster mediante la evaluación de perfiles de densidad ribosomal, construidos a partir de datos públicos derivados del secuenciamiento de los fragmentos transcriptómicos protegidos por ribosomas (Ribo-Seq). Además, se realizó una estimación de la tasa de fuga ribosomal asociada a cada evento de LCP identificado. Con base en la identificación de miles de eventos de LCP, se realizó una caracterización estadística de la frecuencia de uso de nucleótidos en la región proximal al codón de parada en cada transcripto. La asociación de estas dos informaciones a través de un modelo de regresión lineal, permitió dilucidar que el contexto de nucleótidos es un factor molecular determinante en la regulación de la terminación eficiente de la traducción. Este análisis permitió inferir la existencia de patrones que funcionan a modo de señal para la ocurrencia de la LCP. Estos son dependientes de cada codón de parada, sugiriendo la existencia de al menos dos mecanismos que alteran el proceso de terminación traduccional. Estos resultados son también evidencia de que la LCP no constituye un mero error de decodificación, sino que responde a la presencia de factores moleculares programados para la expresión diferencial de productos génicos de baja abundancia. Más allá de contribuir a la mejora en la anotación genómica de la mosca de la fruta, esta tesis profundiza en el conocimiento de los mecanismos que regulan la LCP y proporciona un avance en la comprensión de la expresión génica. En particular, este conocimiento puede ampliar el potencial de las estrategias terapéuticas para patologías genéticas causadas por mutaciones sin sentido, como la fibrosis quística.

scholarly journals Estudios moleculares de la resistencia a insecticidas en triatominos

2018 ◽  
Author(s):  
◽  
Ivana Samanta Sierra
Keyword(s):  
Drosophila Melanogaster ◽  
Apis Mellifera ◽  
Anopheles Gambiae ◽  
Bombyx Mori ◽  
Tribolium Castaneum ◽  
Triatoma Infestans ◽  
Knockdown Resistance ◽  
Gran Chaco ◽  
Expresión Génica ◽  
Vector Base

Según datos de la Organización Mundial de la Salud (OMS), la enfermedad de Chagas es una de las principales enfermedades desatendidas del subcontinente latinoamericano. El agente causante es el parásito protozoario Tripanosoma cruzi, transmitido a humanos por insectos triatominos de distintas especies. Debido a la ausencia de vacunas y tratamientos efectivos para la etapa crónica de la enfermedad, el control del vector sigue siendo el medio elegido para reducir el riesgo de transmisión. Después de casi 30 años de tratamiento con insecticidas piretroides, han emergido poblaciones de Triatoma infestans con altísimos niveles de resistencia, asociadas a fallas en las campañas de control, lo que plantea la necesidad de programas para el manejo de resistencia a nivel regional. Un requerimiento fundamental para ello es la detección temprana de la dispersión de poblaciones e individuos resistentes, así como del surgimiento de nuevos focos. Los piretroides ejercen su acción insecticida modificando el funcionamiento fisiológico de canales proteicos de Na+ dependientes de voltaje (NaV), presentes en la membrana de células excitables. Se conoce como kdr (knockdown resistance) a la reducción en la sensibilidad a piretroides causada por mutaciones puntuales en el gen NaV. El mecanismo de resistencia tipo kdr ha sido descrito en numerosas especies de insectos de interés económico y sanitario. La gran mayoría de las mutaciones correlacionadas con resistencia a piretroides se encuentra en el dominio II de esta proteína. El diseño de ensayos moleculares para detección de mutaciones asociadas a resistencia habilita la detección temprana de dispersión y surgimiento de nuevos focos, al permitir detectar la presencia de dichas mutaciones en insectos individuales, cuando la frecuencia poblacional de las mismas aún es baja. La detección temprana no puede conseguirse con ensayos de toxicidad, que detectan resistencia a nivel poblacional y no individual. En este sentido, en la primera parte de esta Tesis se realizó una evaluación de la sensibilidad y una optimización de los métodos moleculares de detección de mutaciones asociadas a resistencia, seguida de un estudio de la presencia de mutaciones para la región IIS4-IIS6 del gen del canal TiNav presentes en distintas poblaciones de T. infestans resistentes a piretroides provenientes de la ecoregión del Gran Chaco. Por otro lado, a través de una secuencia de TiNav detectada en una base de datos transcriptómica depositada en vector base (https://www.vectorbase.org/), complementada con el clonado y pirosecuenciación de regiones concretas del gen, se obtuvo la secuencia nucleotídica completa del mismo, y se realizó una caracterización bioinformática de la secuencia aminoacídica. Los resultados de esta parte del trabajo podrían tener aplicabilidad en el manejo de resistencia dentro de las campañas de control primario de Chagas. Durante el transcurso de la primera parte de la Tesis hemos encontrado que, aunque las mutaciones en el gen TiNav parecen ser la principal causa de resistencia a piretroides en T. infestans provenientes del Gran Chaco, no toda la resistencia es explicable por estos polimorfismos; distintas poblaciones con la misma frecuencia en una mutación kdr presentaron tasas de resistencia muy variables. Esto puede indicar que existen otros mecanismos de resistencia potencialmente involucrados en el fenómeno, tales como procesos de detoxificación y cambios en la penetrancia cuticular. En la segunda parte de esta Tesis, se realizó un estudio comparativo de la expresión diferentes enzimas detoxificativas entre una población sensible y una resistente de T. infestans provenientes del Gran Chaco. También se estudió la expresión génica en una población sensible expuesta a deltametrina, a fin de estudiar su posible papel en la respuesta detoxificativa a insecticidas piretroides, y posiblemente en la resistencia. Los experimentos mostraron una sobreexpresión de un citocromo P450 del clado 4 en la población resistente de T. infestans del Gran Chaco. No detectamos cambios en la expresión de las enzimas estudiadas cinco horas después de una topicación con deltametrina. Se estudió el rol de una Glutatión Transferasa del clado Delta (deltaGST) en la detoxificación de deltametrina. Se realizaron estudios bioinformáticos y de fisiología molecular usando como modelo Rhodnius prolixus. Se registró un aumento en la letalidad causada por dosis bajas de deltametrina cuando la expresión del gen de gst delta fue disminuida significativamente con técnicas de ARN de interferencia. La llamativa conservación en la estructura, función y farmacología del canal de sodio dependiente de voltaje a través del reino animal, genera que aquellos insecticidas que tengan como blanco esta molécula posean también una toxicidad potencial para otras especies. En este sentido, y teniendo en cuenta que las moléculas del sistema neuroendocrino (neuropéptidos y sus receptores) han sido propuestos como blanco de insecticidas, en el Capítulo 3 se estudió la expresión diferencial de genes precursores de diferentes neuropéptidos entre una población de T. infestans sensible a piretroides y otra resistente, a fin de obtener indicios de su posible papel en procesos asociados a resistencia. Por otra parte, se comparó el efecto de deltametrina en la inducción de la expresión de genes precursores de neuropéptidos en una población susceptible de T. infestans. En el Capítulo 4, a partir de secuencias ortólogas en Anopheles gambiae, Apis mellifera, Bombyx mori, Drosophila melanogaster y Tribolium castaneum, se identificaron genes de receptores de neuropéptidos en transcriptomas de T. infestans, Triatoma dimidiata y Triatoma pallidipennis generados en nuestro laboratorio, así como en el genoma de R. prolixus, por medio de búsquedas en bases de datos y análisis filogenéticos. Se espera que esta última parte del trabajo de Tesis aporte conocimientos para ampliar los horizontes en la investigación de posibles nuevos blancos de insecticidas, que sean capaces de reemplazar o complementar a los neurotóxicos dentro de estrategias de manejo integrado de plagas.

scholarly journals La simbiosis fijadora de nitrógeno Sinorhizobium meliloti - alfalfa (Medicago sativa): Caracterización del rol biológico del ARN pequeño Sm8 en la vida libre y simbiótica de los rizobios

2015 ◽  
Author(s):  
◽  
Antonio Lagares
Keyword(s):  
Medicago Sativa ◽  
Sinorhizobium Meliloti ◽  
Gen Y ◽  
Expresión Génica ◽  
Nuevas Tecnologías

En el marco de las asociaciones benéficas fijadoras de nitrógeno entre bacterias y plantas, se destaca el par simbiótico rizobio-leguminosa integrado por Sinorhizobium meliloti y Medicago sativa (alfalfa), como modelo de referencia para el estudio de estas interacciones. Conocer con precisión los fenómenos moleculares a través de los cuáles se desarrolla la simbiosis entre rizobios y leguminosas, y cómo éstos se encuentran regulados, permite sentar las bases racionales para abordar la manipulación y el mejoramiento de las simbiosis con propósitos prácticos en el marco agroeconómico. Durante los últimos 20 años, el extenso estudio de los fenómenos riboregulatorios en organismos procariotas ha permitido esclarecer la importancia que posee esta forma de regulación de la expresión génica en bacterias. Recientemente, producto del desarrollo de nuevas tecnologías de alto impacto para la caracterización transcriptómica de organismos procariotas, se han identificado cientos de ARNs pequeños no codificantes (sRNAs) que se expresan desde el genoma de S. meliloti en consecuencia a diversos estímulos fisiológicos. Extrapolando las nociones adquiridas a partir de la intensa caracterización de los fenómenos mediados por sRNAs llevada a cabo principalmente en modelos de enterobacterias, hipotetizamos sobre la existencia de una extensa red riboregulatoria en S. meliloti que jugaría un rol distintivo en el ajuste fino de la regulación de la expresión génica en esta bacteria. Un mayor conocimiento acerca de cómo esta red riboregulatoria modula la expresión génica en rizobios se espera ayude a comprender mejor los mecanismos a través de los cuáles estos microorganismos logran adaptarse a las condiciones de estrés ambiental a las que se ven desafiados continuamente. En el presente trabajo de Tesis Doctoral se abordó la caracterización funcional del ARN pequeño no codificante Sm8 en S. meliloti. En primer lugar, se analizó la distribución filogenética e inferencias evolutivas del gen sm8 a través de la búsqueda y el análisis de sus genes homólogos, con el propósito de comprender el origen y la evolución del gen y de su entorno y contar con un marco de referencia valioso para la interpretación biológica. sm8 ha evolucionado a partir de un ancestro remoto común en la rama de las alfa-proteobacterias y se trata del gen codificante para sRNA de S. meliloti más extensamente distribuido y conservado -a nivel secuencial y estructural- en esta clase filogenética. A continuación, se llevó a cabo la caracterización del rol del sRNA Sm8 en S. meliloti durante la vida libre de los rizobios. A través del estudio comparativo del comportamiento de un conjunto de cepas isogénicas de S. meliloti 2011 en las que se alteró la concentración intracelular de Sm8 se logró establecer un vínculo entre la actividad intracelular del sRNA y el flujo metabólico de C hacia la acumulación de reservas bajo la forma de polihidroxibutirato (PHB); la expresión del sRNA en la cepa parental limita la acumulación del compuesto de reserva. Con el propósito de dilucidar las bases moleculares de acción del sRNA en la célula, se realizaron ensayos de transcriptómica y proteómica cuantitativa, orientados a revelar el regulón asociado al sRNA. En este sentido, se identificó un conjunto de genes cuya representatividad en el transcriptoma/proteoma varía -directa o indirectamente- en función de la concentración intracelular de Sm8. El análisis integral de los resultados ha permitido establecer un modelo de regulación metabólica mediado por el sRNA Sm8 en S. meliloti.

scholarly journals Análisis de componentes de gránulos ribonucleoproteicos en Drosophila

2012 ◽  
Author(s):  
◽  
Carla Layana
Keyword(s):  
Drosophila Melanogaster ◽  
Stress Granules ◽  
Processing Bodies ◽  
Expresión Génica

La regulación de la expresión génica es un proceso altamente regulado, que controla qué genes son expresados en cada momento. Uno de los controles más dinámicos del proteoma celular es la regulación de la traducción. El control de la expresión de los mensajeros celulares se ha relacionado hace algunos años con dos estructuras de silenciamiento particulares, los PB (de processing bodies) y los SG (de stress granules). Ambas son formaciones citoplasmáticas que acumulan ARNm y proteínas. Los PB son estructuras constitutivas de las células mientras que los SG aparecen frente a estímulos de estrés celular. En la primera parte de esta tesis se realizó una caracterización de los PB en células S2 Drosophila melanogaster. Particularmente demostramos la presencia de las proteínas Lsm-1, Me31B y eIF4E en los PB. Durante estrés inducido por arsenito de sodio se encontró a eIF4E en SG. Se realizó un estudio más minucioso sobre eIF4E. El análisis de diversos mutantes demostró que el residuo W117, parte del dominio de unión a las 4E-BP, es el responsable de la ubicación de este factor en PB y SG. Mientras que los residuos que participan en la unión al cap de los mensajeros (W100 y W 146) no están involucrados en este proceso. Finalmente se realizó el estudio de interacciones entre estos componentes en PB de células S2 in vivo mediante FRET. Se demostró que las proteínas Lsm-1 y Me31B interaccionan con eIF4E. Sin embargo no pudo ser demostrada por este método la interacción entre Me31B y Lsm-1. Se realizó la predicción de posibles sitios de interacción entre eIF4E y Me31B mediante modelado por homología.

scholarly journals Genómica del desarrollo embrionario de Rhodnius prolixus

2019 ◽  
Author(s):  
◽  
Agustina Pascual
Keyword(s):  
Drosophila Melanogaster ◽  
Rhodnius Prolixus ◽  
Expresión Génica ◽  
Para Determinar

El desarrollo de nuevos y asequibles métodos para la secuenciación de genomas completos, sumado al diseño de grandes proyectos de anotación genómica producen una gran cantidad de información que debe convertirse en datos funcionales. Dentro de este contexto, el análisis comparativo contribuye a generar información clave tanto para comprender la evolución como para la simple identificación génica en organismos desconocidos hasta el momento. Rhodnius prolixus surgió como organismo modelo de estudio en un primer momento para estudios fisiológicos y bioquímicos, los cuales fueron llevados a cabo por Sir V. B. Wigglesworth. Pasados los años y con el advenimiento de las técnicas moleculares, así como también la disponibilidad y acceso a las tecnologías de secuenciación masiva de segunda generación, se re-direccionó el foco de investigación a estudios genéticos. Contando como base con los estudios llevados a cabo en la década del 70 por Erwin Huebner sobre la morfología y citología de la estructura del ovario en R. prolixus, en este trabajo se propuso profundizar su descripción con técnicas moleculares modernas y analizar el perfil transcripcional de los ARN mensajeros durante la oogénesis y embriogénesis, para determinar la expresión génica en las diferentes etapas del desarrollo y validar la función de los genes relacionados con la oogénesis y con su contribución materna al huevo. Se generó información sobre el genoma expresado de R. prolixus desde la etapa de la oogénesis hasta los primeros estadios embrionarios. El material crudo obtenido tras la secuenciación se procesó para efectuar el posterior ensamble. Los transcriptos reconstruidos fueron constatados contra la base de datos generada a partir de los genes conocidos que se expresan durante el desarrollo embrionario de Drosophila melanogaster. De esta manera, se identificó un amplio repertorio de genes que se expresan durante los estadios estudiados, de los cuales se analizaron experimentalmente Bicaudal C, Bicaudal D y cornichon. Estos se validaron funcionalmente mediante la interferencia del ARN (ARNi) parental; en donde se evaluó analizando fertilidad y fenotipo a nivel de ovario, huevo y embrión. Se observó que Bicaudal C presenta un patrón de expresión materno y folicular en el ovario. Actúa manteniendo la estructura del epitelio folicular de manera organizada durante todo el proceso de oogénesis, dando lugar a una acumulación controlada de vitelo y a un correcto establecimiento del corion. Bicaudal D se vio que es necesario para la producción de huevos embrionados. Su silenciamiento génico llevó a la oviposición de huevos en los cuales no fue posible identificar ninguna estructura característica que permita inferir los ejes embrionarios que determinan el patrón corporal. Presenta una expresión génica materna y folicular a nivel del ovario; así como también expresión a nivel embrionario, exceptuando el estadio de cigoto, donde no se evidenció presencia alguna. cornichon no presentó función alguna durante la embriogénesis, aunque sí exhibió una activa expresión génica durante el desarrollo embrionario temprano, desde el estado de huevo no fertilizado hasta embrión gastrulante.

Author response for "Location and arrangement of campaniform sensilla in Drosophila melanogaster"

2020 ◽  
Author(s):  
Gesa F. Dinges ◽  
Alexander S. Chockley ◽  
Till Bockemühl ◽  
Kei Ito ◽  
Alexander Blanke ◽  
...  
Keyword(s):  
Drosophila Melanogaster ◽  
Author Response ◽  
Campaniform Sensilla

Live Confocal Analysis of Fertilization and Early Development

2001 ◽  
Vol 7 (S2) ◽  
pp. 1012-1013
Author(s):  
Uyen Tram ◽  
William Sullivan
Keyword(s):  
Drosophila Melanogaster ◽  
Embryonic Development ◽  
Real Time ◽  
Early Development ◽  
Fluorescent Probes ◽  
Primary Defect ◽  
Fluorescent Analysis ◽  
Dynamic Event ◽  
Enormous Amount ◽  
Fluorescent Studies

Embryonic development is a dynamic event and is best studied in live animals in real time. Much of our knowledge of the early events of embryogenesis, however, comes from immunofluourescent analysis of fixed embryos. While these studies provide an enormous amount of information about the organization of different structures during development, they can give only a static glimpse of a very dynamic event. More recently real-time fluorescent studies of living embryos have become much more routine and have given new insights to how different structures and organelles (chromosomes, centrosomes, cytoskeleton, etc.) are coordinately regulated. This is in large part due to the development of commercially available fluorescent probes, GFP technology, and newly developed sensitive fluorescent microscopes. For example, live confocal fluorescent analysis proved essential in determining the primary defect in mutations that disrupt early nuclear divisions in Drosophila melanogaster. For organisms in which GPF transgenics is not available, fluorescent probes that label DNA, microtubules, and actin are available for microinjection.

Apoptosis and development

2003 ◽  
Vol 39 ◽  
pp. 11-24 ◽  
Author(s):  
Justin V McCarthy
Keyword(s):  
Drosophila Melanogaster ◽  
Mammalian Cells ◽  
Cell Number ◽  
Model Organisms ◽  
Biological Processes ◽  
Nematode Caenorhabditis Elegans ◽  
Apoptotic Pathway ◽  
Genetic Pathways ◽  
Evolutionarily Conserved ◽  
Multicellular Organisms

Apoptosis is an evolutionarily conserved process used by multicellular organisms to developmentally regulate cell number or to eliminate cells that are potentially detrimental to the organism. The large diversity of regulators of apoptosis in mammalian cells and their numerous interactions complicate the analysis of their individual functions, particularly in development. The remarkable conservation of apoptotic mechanisms across species has allowed the genetic pathways of apoptosis determined in lower species, such as the nematode Caenorhabditis elegans and the fruitfly Drosophila melanogaster, to act as models for understanding the biology of apoptosis in mammalian cells. Though many components of the apoptotic pathway are conserved between species, the use of additional model organisms has revealed several important differences and supports the use of model organisms in deciphering complex biological processes such as apoptosis.

Insights into amyloid disease from fly models

2014 ◽  
Vol 56 ◽  
pp. 69-83 ◽  
Author(s):  
Ko-Fan Chen ◽  
Damian C. Crowther
Keyword(s):  
Drosophila Melanogaster ◽  
Neurodegenerative Disorders ◽  
Amyloid Β ◽  
Amyloid Β Peptide ◽  
Disease Pathogenesis ◽  
Amyloid Aggregates ◽  
Aβ Amyloid ◽  
Polypeptide Chains ◽  
Amyloid Diseases

The formation of amyloid aggregates is a feature of most, if not all, polypeptide chains. In vivo modelling of this process has been undertaken in the fruitfly Drosophila melanogaster with remarkable success. Models of both neurological and systemic amyloid diseases have been generated and have informed our understanding of disease pathogenesis in two main ways. First, the toxic amyloid species have been at least partially characterized, for example in the case of the Aβ (amyloid β-peptide) associated with Alzheimer's disease. Secondly, the genetic underpinning of model disease-linked phenotypes has been characterized for a number of neurodegenerative disorders. The current challenge is to integrate our understanding of disease-linked processes in the fly with our growing knowledge of human disease, for the benefit of patients.

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