Διερεύνηση του ρόλου της γενετικής ποικιλομορφίας των Core/Core+1 πρωτεϊνών του ιού της ηπατίτιδας C στη βιολογική δράση των ιικών πρωτεϊνών και στην παθογένεια της λοίμωξης από τον ιό

Η μόλυνση με τον ιό της ηπατίτιδας C (HCV) αποτελεί ένα από τα συχνότερα αίτια χρόνιας ηπατικής νόσου, η οποία συχνά οδηγεί σε στεάτωση, κίρρωση και καρκίνο του ήπατος, ενώ περισσότεροι από 115 εκατομμύρια άνθρωποι, είναι φορείς του ιού παγκοσμίως. Ο HCV ανήκει στο γένος Hepacivirus της οικογένειας Flaviviridae. Το γονιδίωμα του ιού συνίσταται σε ένα μονόκλωνο RNA θετικής πολικότητας μεγέθους 9.600 βάσεων, το οποίο κωδικοποιεί μια πολυπρωτεΐνη που διασπάται στη συνέχεια από κυτταρικές και ιικές πρωτεάσες σε 10 ώριμες πρωτεΐνες, δομικές και μη δομικές. Η μετάφραση του ιικού γονιδιώματος ρυθμίζεται από μία περιοχή εσωτερικής πρόσδεσης ριβοσώματος (IRES), εντός της 5΄ μη μεταφραζόμενης περιοχής. Το γονιδίωμα του ιού περιλαμβάνει ένα δεύτερο λειτουργικό ανοιχτό πλαίσιο ανάγνωσης (ORF) εντός της περιοχής της καψιδιακής πρωτεΐνης core, το οποίο κωδικοποιεί μία επιπλέον πρωτεΐνη γνωστή ως ARFP (alternative reading frame protein), F ή core+1. Δύο ισομορφές της core+1 έχουν ανιχνευθεί, μία μικρή (core+1/Short) και μία μεγαλύτερη (core+1/Long) οι οποίες παράγονται πιθανότατα μέσω μηχανισμού εσωτερικής έναρξης της μετάφρασης σε διαφορετικό σημείο. Ο βιολογικός ρόλος της πρωτεΐνης core+1/ARF βρίσκεται υπό διερεύνηση. Πολλές, ανεξάρτητες μελέτες υποστηρίζουν την έκφραση της core+1/ARF πρωτεΐνης κατά τη διάρκεια της φυσικής μόλυνσης, μέσω της ανίχνευσης ειδικών αντισωμάτων έναντι της core+1/ARF, σε ορούς ασθενών με οξεία ή χρόνια HCV λοίμωξη. Στόχος της παρούσας διδακτορικής διατριβής αποτελεί η περεταίρω μελέτη της βιολογικής δράσης της core+1 πρωτεΐνης στην παθογένεια της λοίμωξης από τον ιό της ηπατίτιδας C καθώς και η διερεύνηση των μοριακών μηχανισμών έκφρασής της. Αρχικά, προσδιορίστηκε για πρώτη φορά ο επιπολασμός των αντισωμάτων έναντι της core+1/ARF πρωτεΐνης σε HCV ασθενείς με κίρρωση του ήπατος. Με τη χρήση ενός πρωτοκόλλου “home-made” ELISA, προσδιορίστηκε το επίπεδο των αντισωμάτων σε χρόνιους HCV ασθενείς που βρίσκονται σε διαφορετικό στάδιο κίρρωσης, καθώς και σε χρόνιους HCV ασθενείς χωρίς κίρρωση. Αντισώματα έναντι της core+1/ARFP εντοπίστηκαν στο 28.7% και το 16.5% των κιρρωτικών και μη κιρρωτικών ασθενών, αντίστοιχα (p=0.0026). Επιπλέον, ο επιπολασμός των αντι-core+1 αντισωμάτων βρέθηκε σημαντικά αυξημένος στους κιρρωτικούς ασθενείς που βρίσκονται σε προχωρημένο στάδιο κίρρωσης (MELD≥15) (36.7%) σε σχέση με τους κιρρωτικούς ασθενείς αρχικού σταδίου (MELD<15) (24%) (p<0.05). Παρατηρήθηκε επίσης, ότι τα επίπεδα της τρανσαμινάσης ALT ήταν σημαντικά μειωμένα στους κιρρωτικούς ασθενείς οι οποίοι είναι θετικοί σε αντι-core+1 αντισώματα (p=0.0145). Τα ευρήματά μας σε συνδυασμό με προηγούμενα δεδομένα του εργαστηρίου μας, που δείχνουν υψηλή θετικότητα σε αντισώματα έναντι της core+1/ARFP σε HCV ασθενείς με ηπατοκυτταρικό καρκίνο, υποδηλώνουν ένα πιθανό ρόλο της πρωτεΐνης στην παθογένεια της λοίμωξης και υποστηρίζουν ότι η παρουσία των αντισωμάτων έναντι της core+1/ARFP μπορεί πιθανόν να χρησιμοποιηθεί ως προγνωστικός βιοδείκτης της εξέλιξης της νόσου. Στη συνέχεια της παρούσας διατριβής μελετήθηκε η έκφραση της core+1/ARF πρωτεΐνης με χρήση δύο διαφορετικών συστημάτων μελέτης. (α) Αρχικά, χρησιμοποιήθηκαν οι δισιστρονικοί αυτοαντιγραφόμενοι φορείς του ιού της ηπατίτιδας C (JFH1 replicons) προκειμένου να επιτευχθεί η σήμανση του core+1 ORF με luc tag και να διερευνηθεί περαιτέρω ο μοριακός μηχανισμός μέσω του οποίου ρυθμίζεται η έκφραση της core+1/L(Long) ισομορφής. Οι εν λόγω φορείς, περιέχουν την αλληλουχία που κωδικοποιεί για την πρωτεΐνη core, συζευγμένη με το γονίδιο της λουσιφεράσης Firefly στο +1 ORF. Στους αυτοαντιγραφόμενους φορείς πραγματοποιήθηκε εισαγωγή νουκλεοτιδικών μεταλλαγών, οι οποίες οδηγούν σε λήξη της μετάφρασης σε κωδικόνια της core κωδικής αλληλουχίας προκειμένου να διερευνηθεί η πιθανή συσχέτιση της έκφρασης των επικαλυπτόμενων core και core+1 ORFs. Η έκφραση της core+1/ARF πρωτεΐνης μετρήθηκε μετά από τη διαμόλυνση κυττάρων ηπατοκαρκινώματος με τους μεταλλαγμένους φορείς. Τα αποτελέσματά μας υποστηρίζουν ότι πιθανότατα η έκφραση της core+1/ARF πρωτεΐνης διαμεσολαβείται μέσω ενός εναλλακτικού μηχανισμού μετάφρασης, όπως η «παρέκκλιση του ριβοσώματος» (ribosomal shunting). (β) Παράλληλα, πραγματοποιήθηκε η παραγωγή ενός πολυκλωνικού αντισώματος έναντι ανασυνδυασμένης core+1/ARF πρωτεΐνης του μολυσματικού στελέχους HCV/JFH1, με σκοπό τη διερεύνηση της έκφρασης της πρωτεΐνης core+1/ARF κατά τη διάρκεια της μόλυνσης από JFH1 full-length replicons, σε ένα in vitro σύστημα αναπαραγωγής του HCV. Ωστόσο, η ανίχνευση της πρωτεΐνης core+1/ARF στο ανωτέρω σύστημα δεν κατέστη δυνατή. Τέλος, η διερεύνηση της παρουσίας μεταλλαγών/γενετικής ποικιλομορφίας στην core/core+1 περιοχή κλινικών HCV στελεχών γονοτύπου 2 οδήγησε στον εντοπισμό και χαρακτηρισμό, για πρώτη φορά, ανασυνδυασμένων HCV στελεχών στην Ελλάδα. Η ανίχνευση των στελεχών πραγματοποιήθηκε ύστερα από την παρατήρηση ότι ένα ασυνήθιστα μεγάλο ποσοστό ασθενών με HCV, γονοτύπου 2, δεν ανταποκρινόταν στη θεραπεία με Peg-IFNα/Ribavirin. Η αλληλουχία του ιικού γονιδιώματος των HCV στελεχών αναλύθηκε με PCR-sequencing, με σκοπό την ανίχνευση μεταλλαγών στην περιοχή core/core+1, που έχουν συσχετιστεί με ανθεκτικότητα στη θεραπεία. Τα αποτελέσματα της αλληλούχισης της core-Ε1 περιοχής του ιού αποκάλυψαν ότι τρείς από τους ασθενείς ήταν μολυσμένοι με HCV στελέχη τα οποία σχετίζονται φυλογενετικά με το διαγονοτυπικό ανασυνδυασμένο 2k/1b στέλεχος που πρωτοεμφανίστηκε στη Ρωσία (RF1_ 2k/1b). Περαιτέρω ανάλυση πραγματοποιήθηκε με στόχο τη διερεύνηση των χαρακτηριστικών που προσδίδουν την ανθεκτικότητα στην IFN. Η ανίχνευση ανασυνδυασμένων στελεχών έχει μεγάλη σημασία για την επιλογή του κατάλληλου θεραπευτικού πρωτοκόλλου στην περίπτωση χορήγησης IFN/RBV.

Alternative reading frame protein (ARF)-independent function of CARF (collaborator of ARF) involves its interactions with p53: evidence for a novel p53-activation pathway and its negative feedback control

CARF, a collaborator of ARF (alternative reading frame protein), was cloned as a novel ARF-binding protein from a yeast-interaction screen. It potentiated ARF-mediated p53 function, and also caused a moderate increase in p53 activity in the absence of ARF. We herein report the molecular mechanism of ARF-independent function of CARF. By employing a variety of approaches, including overexpression of CARF, its suppression by small interfering RNA and use of protease inhibitors, we demonstrate that: (i) CARF directly interacts with wild-type p53, causing its stabilization and functional activation; and (ii) CARF and p53 levels show an inverse relationship that is instigated by a negative-feedback control via a proteasome-mediated degradation pathway.