Real-time PCR monitoring of fungal development in Arabidopsis thaliana infected by Alternaria brassicicola and Botrytis cinerea

Επιγενετικές τροποποιήσεις που προκαλούνται από βιοτικές ή αβιοτικές καταπονήσεις δύνανται να επηρεάσουν σημαντικά την έκφραση γονιδίων που σχετίζονται με την άμυνα των φυτών εναντίον παθογόνων μικροοργανισμών. Η επιγενετική κληρονομικότητα αναφέρεται στη διατήρηση ορισμένων εξ’ αυτών των τροποποιήσεων στην επόμενη γενεά. Το αντικείμενο της συγκεκριμένης διατριβής είναι η μελέτη του μηχανισμού μέσω του οποίου ένα ωφέλιμο για τα φυτά βακτήριο το Paenibacillus alvei K165 προσδίδει κληρονομούμενη ανθεκτικότητα εναντίον του φυτοπαθογόνου μύκητα Verticillium dahliae, μέσω της εφαρμογής του σε μητρικά φυτά Arabidopsis thaliana, το οποίο επιβεβαιώθηκε και με ενδοφυτική ποσοτικοποίηση του μύκητα. Πραγματοποιήθηκαν μεταγραφωμικές και μεταβολομικές αναλύσεις στο υπέργειο μέρος φυτών στα οποία εφαρμόστηκε το στέλεχος Κ165 καθώς και των απογόνων τους ώστε να μελετηθεί η ανθεκτικότητά τους εναντίον του μύκητα Verticillium dahliae. Τα αποτελέσματα της μεταγραφωμικής ανάλυσης κατέδειξαν έναν σημαντικό αριθμό γονιδίων με ρόλο στο μονοπάτι βιοσύνθεσης φαινυλοπροπανοειδών των οποίων η έκφραση επηρεάζεται σημαντικά τόσο στα ίδια τα φυτά που εφαρμόστηκε το στέλεχος Κ165 όσο και στους απογόνους τους. Επίσης φαίνεται πως τόσο το μονοπάτι του σαλικυλικού οξέος όσο και αυτό του ιασμονικού/αιθυλενίου ενεργοποιούνται μέσω της εφαρμογής του στελέχους Κ165. Οι μεταβολομικές αναλύσεις έδειξαν σαφή διαφοροποίηση των μεταβολομικών προφίλ των εφαρμογών που ελέχθησαν καθώς και αύξηση του μεταβολισμού των λιπιδίων στα φυτά που δέχθηκαν την εφαρμογή του στελέχους Κ165 και στους απόγονους τους. Για επιβεβαίωση των αποτελεσμάτων της μεταγραφομικής ανάλυσης πραγματοποιήθηκε μελέτη της έκφρασης ενός σημαντικού αριθμού γονιδίων των οποίων η έκφραση φάνηκε ότι επηρεάζεται τόσο στα ίδια τα φυτά που εφαρμόστηκε το στέλεχος Κ165 όσο και στους απογόνους τους. Τα γονίδια που μελετήθηκαν έχουν βασικό ρόλο στην άμυνα των φυτών και συμμετέχουν στα μονοπάτια του σαλικυλικού οξέος, του ιασμονικού/αιθυλενίου και της βιοσύνθεσης φαινυλοπροπανοειδών. Η μελέτη της έκφρασης των γονιδίων PR1, PR5, NPR1 και PDF1.2 έδειξε πως ενώ τις πρώτες ημέρες από την εφαρμογή του μύκητα υπάρχει ενεργοποίηση και του μονοπατιού του σαλικυλικού οξέος, αργότερα την σκυτάλη φαίνεται να αναλαμβάνει το μονοπάτι ιασμονικού/αιθυλενίου καθώς παρατηρείται σημαντική υπερέκφραση του γονιδίου PDF1.2 στα φυτά που εφαρμόστηκε το βακτήριο. Ωστόσο στους ανθεκτικούς απογόνους παρατηρείται παράλληλη ενεργοποίηση των δύο μονοπατιών. Όσον αφορά στο μονοπάτι βιοσύνθεσης φαινυλοπροπανοειδών φαίνεται πως πράγματι, ένας μεγάλος αριθμός γονιδίων επηρεάζεται σημαντικά στα φυτά που εφαρμόστηκε το στελέχος Κ165 και στους απογόνους αυτών. Ωστόσο, το γονίδιο CAD8 ξεχωρίζει μέσω της σημαντικής υπερέκφρασής του στους ανθεκτικούς απογόνους και το γονίδιο 4CL2 μέσω της μεγάλης υπερέκφρασής του στα φυτά που εφαρμόστηκε το στέλεχος Κ165 ενώ το γονίδιο CCR2 παρουσιάζει μεγάλη υπερέκφραση στους ανθεκτικούς απογόνους και ακόμα μεγαλύτερη στα ίδια τα φυτά στα οποία εφαρμόζεται το βακτήριο. Αντιθέτως ο μύκητας φαίνεται πως μειώνει την έκφραση του συγκεκριμένου γονιδίου. Μετρήθηκε επίσης η συγκέντρωση της λιγνίνης στο υπέργειο μέρος των φυτών με τη χρήση φασματοφωτομετρίας, καθώς πρόκειται για το τελικό προϊόν που παράγεται από την ενεργοποίηση του μονοπατιού βιοσύνθεσης φαινυλοπροπανοειδών στα φυτά. Οι μετρήσεις επιβεβαίωσαν την αυξημένη συσσώρευση λιγνίνης στα φυτά που δέχθηκαν την εφαρμογή του στελέχους Κ165 αλλά και στους απογόνους αυτών. Με τη πραγματοποίηση πειραμάτων παθογένειας σε μεταλλαγμένες σειρές Arabidopsis thaliana μελετήθηκε ο ρόλος των γονιδίων CAD1, CAD6, CAD8 των οποίων η έκφραση φαίνεται να επηρεάζεται σημαντικά στους ανθεκτικούς απογόνους. Τα αποτελέσματα των πειραμάτων παθογένειας επιβεβαίωσαν τον ρόλο των παραπάνω γονιδίων στη πρόκληση του φαινομένου καθώς το στέλεχος Κ165 απέτυχε να προστατέψει τα μεταλλαγμένα φυτά και τους απογόνους τους από τον μύκητα V. dahliae. Η ενδοφυτική ποσοτικοποίηση του μύκητα επίσης έδειξε ότι δεν υπάρχει μείωση της συγκέντρωσης του μύκητα στα φυτά που δέχθηκαν το στέλεχος Κ165 ή στους απογόνους αυτών. Πραγματοποιήθηκαν ακόμα πειράματα ανοσοκατακρίμνησης χρωματίνης και ανοσοαπoτυπώματος κατά western με σκοπό να επιβεβαιωθεί η επιγενετική φύση του φαινομένου μέσω του εντοπισμού κληρονομούμενων επιγενετικών τροποποιήσεων που προκαλεί το στέλεχος Κ165. Τα επίπεδα ακετυλίωσης συνολικά στο γονιδίωμα των ανθεκτικών απογόνων βρέθηκαν αυξημένα σε σχέση με τον μάρτυρα. Χρησιμοποιήθηκαν εξειδικευμένα αντισώματα για τον εντοπισμό ακετυλιώσεων στην ιστόνη 3 και μελετήθηκαν τα επίπεδα ακετυλίωσης των γονιδίων PR1, PR5, PDF1.2, CAD4 και CAD8 στις περιοχές των υποκινητών και στο ανοιχτό πλαίσιο ανάγνωσης με τη χρήση της μεθόδου Real time PCR. Τα επίπεδα ακετυλίωσης στους υποκινητές των γονιδίων PR1, PDF1.2, CAD4 και CAD8 των ανθεκτικών απογόνων βρέθηκαν ιδιαίτερα αυξημένα σε σχέση με τους μάρτυρες. Τέλος, μελετήθηκε ο ρόλος των γονιδίων που είναι υπεύθυνα για την ακετυλίωση των αμινοξέων της ιστόνης 3 στην πρόκληση της επιγενετικά κληρονομούμενης ανθεκτικότητας μέσω πραγματοποίησης πειραμάτων παθογένειας σε μεταλλαγμένες σειρές Arabidopsis thaliana. Τα αποτελέσματα επιβεβαίωσαν τον ρόλο των HAC και HAG ακετυλοτρανσφερασών στη πρόκληση της κληρονομούμενης ανθεκτικότητας από το στέλεχος Κ165 καθώς αυτό απέτυχε να μειώσει τα συμπτώματα που προκαλεί ο μύκητας στα μεταλλαγμένα φυτά που εφαρμόστηκε το βακτήριο και τους απογόνους αυτών. Η ενδοφυτική ποσοτικοποίηση του μύκητα επίσης έδειξε ότι δεν υπάρχει μείωση της συγκέντρωσης του μύκητα στα φυτά που δέχθηκαν το στέλεχος Κ165 ή στους απογόνους αυτών.

Download Full-text

АНАЛИЗ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ В КЛЕТКАХ СУСПЕНЗИОННОЙ КУЛЬТУРЫ ARABIDOPSIS THALIANA С ПОНИЖЕННОЙ ЭКСПРЕССИЕЙ ГЕНА NDB2

Siberian Journal of Life Sciences and Agriculture ◽

10.12731/2658-6649-2021-13-2-185-201 ◽

2021 ◽

Vol 13 (2) ◽

pp. 185-201

Author(s):

Irina V. Fedoseeva ◽

Alexander I. Katyshev ◽

Anna V. Fedyaeva ◽

Alexey V. Stepanov ◽

Gennadii B. Borovskii

Keyword(s):

Arabidopsis Thaliana ◽

Real Time ◽

Real Time Pcr ◽

Detection System ◽

Pcr Detection ◽

Rna Purification

Обоснование. Альтернативный путь дыхания митохондрий растений не связан с синтезом АТФ и, следовательно, не контролируется непосредственно энергетическим статусом клетки. Альтернативный дыхательный путь включает в себя ротенон нечувствительные NAD(Р)Н дегидрогеназы II типа, расположенные как на внешней, так и на внутренней поверхности внутренней мембраны митохондрий, убихинон и альтернативную оксидазу (AOX). Предполагается, что альтернативные NAD(P)H дегидрогеназы имеют функции, сходные с функциями AOX, среди которых термогенез, предотвращение образования АФК, окисление избытка восстановителей для продолжения метаболических путей и др. Публикаций об успешном подавлении экспрессии NDB2 пока недостаточно. Например, показано, что растения арабидопсиса, лишенные и AOX1a и NDB2 были более чувствительны к комбинированной засухе и повышенному освещению, в то время как растения, гиперэкспрессирующие эти гены, демонстрировали повышенную устойчивость и способность к постстрессовому восстановлению. Цель. Целью данной работы являлось изучить, как подавление экспрессии NDB2 в гетеротрофных клетках суспензионной культуры арабидопсиса повлияет на экспрессию других генов альтернативного пути дыхания, разобщающих белков, а также генов белков теплового шока в не стрессовых условиях. Материалы и методы. Для выделения РНК отбирали по 5 мл клеток суспензионных культур. РНК выделяли с помощью реактивов из набора GeneJET Plant RNA Purification Mini Kit (Thermo Scientific, Литва), согласно инструкции производителя. Синтез первой цепи кДНК осуществляли с использованием набора реактивов Thermo Scientific (Литва), согласно рекомендациям фирмы производителя. ПЦР-РВ проводили на приборе CFX96™ Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad, США), используя набор реактивов qPCR mix-HS SYBR (Евроген, Россия), согласно инструкции производителя. Анализ данных ПЦР-РВ проводили с помощью программного обеспечения SFX Manager (Bio-Rad, Германия). Все эксперименты проводились в двух аналитических и трех биологических повторностях. В качестве референсного гена использовали ген, кодирующий глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназу – GAPD. Результаты. Количество мРНК гена NDB2 в клетках суспензионной культуры линии AS5 было снижено в 8,2 раза по сравнению с контролем Col-0. Подавление экспрессии гена NDB2 в клетках суспензионной культуры арабидопсиса линии AS5 приводило к увеличению количества транскриптов не только гена NDB4, но и NDB1, а также NDA2 и NDC1; в то же время экспрессия генов NDB3 и NDA1 снижалась по сравнению с клетками Col-0. Мы не обнаружили изменения уровней экспрессии генов AOX1a, AOX1b и AOX1d в клетках линии AS5 по сравнению с контролем, однако количество транскриптов гена AOX1c несколько увеличивалось. При анализе уровней экспрессии генов, кодирующих разобщающие белки, было обнаружено увеличение экспрессии гена UCP1 в клетках линии AS5. В клетках суспензионной культуры линии AS5 повышались уровни экспрессии всех исследуемых нами генов БТШ, кроме HSP17.7. Заключение. Таким образом, полученные результаты предполагают, что подавление экспрессии гена NDB2 в гетеротрофных клетках арабидопсиса в отсутствие стресса изменяет редокс-статус клетки, что, в свою очередь, приводит к изменениям уровней накопления транскриптов других генов NAD(Р)Н дегидрогеназ и увеличению экспрессии генов БТШ, при этом экспрессия ключевых генов AOX не изменяется.

Download Full-text