SYBR Green I promotes melamine binding to poly-thymine DNA and FRET-based ratiometric sensing

The Analyst ◽  
2021 ◽  
Vol 146 (5) ◽  
pp. 1642-1649
Author(s):  
Fan He ◽  
Yudong Shen ◽  
Juewen Liu
Keyword(s):  
Dna Binding ◽  
Sybr Green ◽  
Sybr Green I ◽  
Dna Melting ◽  
Ratiometric Sensing ◽  
Intramolecular Reaction ◽  
Melting Experiments

Using SYBR Green I for DNA melting experiments, polythymine DNA binding to melamine was found to be an intramolecular reaction, allowing the design of a FRET-based biosensor and its sensitivity was enhanced by SYBR Green I.

scholarly journals Amplicon DNA Melting Analysis for Mutation Scanning and Genotyping: Cross-Platform Comparison of Instruments and Dyes

2006 ◽  
Vol 52 (3) ◽  
pp. 494-503 ◽  
Author(s):  
Mark G Herrmann ◽  
Jacob D Durtschi ◽  
L Kathryn Bromley ◽  
Carl T Wittwer ◽  
Karl V Voelkerding
Keyword(s):  
High Resolution ◽  
Globin Gene ◽  
Melting Curve ◽  
Sybr Green ◽  
Sybr Green I ◽  
Dna Melting ◽  
Curve Shape ◽  
Comparative Performance ◽  
Mutation Scanning ◽  
Melting Analysis

Abstract Background: DNA melting analysis for genotyping and mutation scanning of PCR products by use of high-resolution instruments with special “saturation” dyes has recently been reported. The comparative performance of other instruments and dyes has not been evaluated. Methods: A 110-bp fragment of the β-globin gene including the sickle cell anemia locus (A17T) was amplified by PCR in the presence of either the saturating DNA dye, LCGreen Plus, or SYBR Green I. Amplicons of 3 different genotypes (wild-type, heterozygous, and homozygous mutants) were melted on 9 different instruments (ABI 7000 and 7900HT, Bio-Rad iCycler, Cepheid SmartCycler, Corbett Rotor-Gene 3000, Idaho Technology HR-1 and LightScanner, and the Roche LightCycler 1.2 and LightCycler 2.0) at a rate of 0.1 °C/s or as recommended by the manufacturer. The ability of each instrument/dye combination to genotype by melting temperature (Tm) and to scan for heterozygotes by curve shape was evaluated. Results: Resolution varied greatly among instruments with a 15-fold difference in Tm SD (0.018 to 0.274 °C) and a 19-fold (LCGreen Plus) or 33-fold (SYBR Green I) difference in the signal-to-noise ratio. These factors limit the ability of most instruments to accurately genotype single-nucleotide polymorphisms by amplicon melting. Plate instruments (96-well) showed the greatest variance with spatial differences across the plates. Either SYBR Green I or LCGreen Plus could be used for genotyping by Tm, but only LCGreen Plus was useful for heterozygote scanning. However, LCGreen Plus could not be used on instruments with an argon laser because of spectral mismatch. All instruments compatible with LCGreen Plus were able to detect heterozygotes by altered melting curve shape. However, instruments specifically designed for high-resolution melting displayed the least variation, suggesting better scanning sensitivity and specificity. Conclusion: Different instruments and dyes vary widely in their ability to genotype homozygous variants and scan for heterozygotes by whole-amplicon melting analysis.

The influence of SYBR Green I on isothermal amplification with Bst exo DNA polymerase.

Biomics ◽  
2018 ◽  
Vol 10 (3) ◽  
pp. 268-273
Author(s):  
A.R. Gilvanov ◽  
A.R. Sakhabutdinova ◽  
A.V. Chemeris ◽  
R.R. Garafutdinov
Keyword(s):  
Dna Polymerase ◽  
Sybr Green ◽  
Isothermal Amplification ◽  
Sybr Green I

Label-free fluorescence assay coupled exonuclease reaction and SYBR Green I for the detection of T4 polynucleotide kinase activity

2020 ◽  
Vol 12 (6) ◽  
pp. 807-812
Author(s):  
Xu Wu ◽  
Shuyi He ◽  
Julia Xiaojun Zhao
Keyword(s):  
Kinase Activity ◽  
Sybr Green ◽  
Fluorescence Assay ◽  
Sybr Green I ◽  
Label Free ◽  
Cleavage Reaction ◽  
Polynucleotide Kinase ◽  
T4 Polynucleotide Kinase

A sensitive label-free fluorescence assay for monitoring T4 polynucleotide kinase (T4 PNK) activity and inhibition was developed based on a coupled λ exonuclease cleavage reaction and SYBR Green I.

Μελέτη επιγενετικών και φαρμακοεπιγενετικών βιοδεικτών στο σακχαρώδη Διαβήτη τύπου ΙΙ

2019 ◽  
Author(s):  
Μακρίνα Καραγλάνη
Keyword(s):  
Sybr Green ◽  
Sybr Green I

Ο ΣΔΤ2 χαρακτηρίζεται από ανεπαρκή λειτουργία των παγκρεατικών β-κυττάρων, αντίσταση στην ινσουλίνη και χρόνια φλεγμονή, τα οποία οδηγούν προοδευτικά στην εμφάνιση της υπεργλυκαιμίας. Η φαρμακοθεραπεία του ΣΔΤ2, ως χρόνια νόσος, πρέπει να είναι αποτελεσματική και με ελάχιστες παρενέργειες. Η έγκαιρη ανίχνευση του συνεχιζόμενου β-κυτταρικού θανάτου θα επέτρεπε έγκαιρες θεραπευτικές παρεμβάσεις πριν από την εμφάνιση υπεργλυκαιμίας και των επιπλοκών της, όταν ακόμα θα υπάρχει ένας σημαντικός αριθμός β-κυττάρων. Γνωρίζουμε ότι το επιγονιδίωμα του β-κυττάρου παίζει καθοριστικό ρόλο στην παθοφυσιολογία του ΣΔΤ2, ιδιαίτερα οι αλλαγές στα πρότυπα της DNA μεθυλίωσης. Τα τελευταία χρόνια δόθηκε ιδιαίτερη προσοχή στην ανάπτυξη ελάχιστα επεμβατικών βιοδεικτών υγρής βιοψίας. Το ccfDNA προτείνεται ότι αντανακλά αξιόπιστα τα επιγενετικά γεγονότα που λαμβάνουν χώρα στον πάσχοντα ιστό. Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν η ανάδειξη ελάχιστα επεμβατικών επιγενετικών και φαρμακοεπιγενετικών βιοδεικτών στον ΣΔΤ2. Συγκεκριμένα, στόχος της επιγενετικής μελέτης ήταν η μελέτη της δομής του ccfDNA με στόχο την ανάπτυξη και την επικύρωση ενός παγκρεατικού β-κυτταροειδικού μοντέλου/προτύπου ταξινόμησης (ταξινομητή) βασισμένου στην DNA μεθυλίωση του ccfDNA ως βιοδείκτη του ΣΔΤ2. Στην φαρμακοεπιγενετική μελέτη στόχος ήταν να διερευνηθεί αν η ανάπτυξη υπογλυκαιμίας κατά την αγωγή με σουλφονυλουρίες επηρεάζεται από επιγενετικούς παράγοντες ανεξάρτητα ή σε συνδυασμό με γενετικούς.Στην επιγενετική μελέτη, αρχικά, ποσοτικοποιήθηκαν τα επίπεδα του συνολικού ccfDNA με φασματομετρία φθορισμού (δοκιμασία Qubit) και παρατηρήθηκε ότι τα διάμεσα επίπεδα αυτού δεν διέφεραν μεταξύ των ασθενών και των υγιών μαρτύρων αλλά και των ατόμων με προδιαβήτη. Ακολούθησε η ανάλυση του μεγέθους των θραυσμάτων του ccfDNA με τριχοειδή ηλεκτροφόρηση σε επιλεγμένα δείγματα, προκειμένου να αποκαλυφθούν για πρώτη φορά πληροφορίες σχετικά με την κυτταρική διαδικασία απελευθέρωσης του ccfDNA από τον/τους ιστό/ούς προέλευσης του στον ΣΔ. Στην ομάδα των ασθενών με ΣΔΤ2 εντοπίστηκαν συχνότερα κορυφές μεγέθους ~160bp σε σχέση με τους υγιείς μάρτυρες, γεγονός που υποδηλώνει κυτταρική απελευθέρωση του ccfDNA κατά τη διάρκεια της απόπτωσης πιθανόν λόγω του συνεχιζόμενου θανάτου των παγκρεατικών β-κυττάρων (η παρατήρηση αυτή ήταν ποιοτική). Επίσης, αναλύθηκε για πρώτη φορά με φασματοσκοπία Raman το ccfDNA μικρού αριθμού επιλεγμένων δειγμάτων προκειμένου να εκτιμηθεί το ολικό φορτίο της DNA μεθυλίωσης όπως και γενικά μοτίβα χημικών δεσμών. Στα δείγματα ccfDNA των ασθενών παρατηρήθηκε να είναι υψηλότερη η κορυφή του φάσματος που αντιστοιχεί στη δομή των μεθυλομάδων σε σχέση με τους υγιείς μάρτυρες, γεγονός που υποδηλώνει ότι το ccfDNA των ασθενών είναι περισσότερο μεθυλιωμένο. Επιπλέον, αναλύθηκε το προφίλ της DNA μεθυλίωσης πέντε παγκρεατικών β-κυτταροειδικών γονιδίων (INS, IAPP, GCK, KCNJ11 και ABCC8) στο ccfDNA με ποσοτική qMSP με χρήση της φθορίζουσας χρωστικής SYBR Green I. Στην ομάδα ανάπτυξης, για σχεδόν όλα τα υπό μελέτη γονίδια, τα μη μεθυλιωμένα αλληλόμορφα (που υποδηλώνουν προέλευση από τα παγκρεατικά β κύτταρα) ήταν στατιστικώς σημαντικά αυξημένα στους ασθενείς με ΣΔΤ2 έναντι των υγιών μαρτύρων, πιθανώς λόγω του συνεχιζόμενου θανάτου των παγκρεατικών β-κυττάρων. Η ανάλυση των αποτελεσμάτων και των πέντε γονιδίων με χρήση της λογιστικής παλινδρόμησης, οδήγησε σε έναν ταξινομητή με πολύ υψηλή ακρίβεια, ευαισθησία και ειδικότητα ως βιοδείκτη του ΣΔΤ2, που μπορεί να αποτελέσει ένα χρήσιμο ελάχιστα επεμβατικό εργαλείο στην κλινική διαχείριση του ΣΔΤ2 αλλά και του ΣΔ γενικότερα. Προκειμένου να επικυρωθεί ο ταξινομητής, χρησιμοποιήθηκε μία δεύτερη ανεξάρτητη ομάδα μελέτης (η οποία περιλάμβανε άτομα με προδιαβήτη), στην οποία αναλύθηκε το προφίλ της DNA μεθυλίωσης για τα πέντε β-κυτταροειδικά γονίδια και τα αποτελέσματα εισήχθησαν στον ανεπτυγμένο ταξινομητή. Παρατηρήθηκε ότι η απόδοση του ταξινομητή μειώθηκε αρκετά, πιθανώς εξαιτίας του μικρού αριθμού ατόμων αυτής της ομάδας μελέτης και της μη ειδικής συλλογής και αποθήκευσης δειγμάτων με τα βελτιστοποιημένα πρωτόκολλα.Στην φαρμακοεπιγενετική μελέτη αναλύθηκε το προφίλ της DNA μεθυλίωσης των γονιδίων KCNJ11 και ABCC8 σε gDNA λευκοκυττάρων περιφερικού αίματος απομονωμένο από ασθενείς με ΣΔT2 που λάμβαναν σουλφονυλουρίες ως θεραπευτική αγωγή. Τα αποτελέσματα ανέδειξαν ότι μόνο η μεθυλίωση του γονιδίου ABCC8 μπορεί να επηρεάσει την εμφάνιση υπογλυκαιμικών ανεξαρτήτως του γονότυπου KCNJ11 Ε23Κ του ασθενούς. Ωστόσο, η παρουσία μεθυλίωσης σε τουλάχιστον έναν υποκινητή (KCNJ11 ή ABCC8) συσχετίστηκε σημαντικά με τους μη υπογλυκαιμικούς ασθενείς οι οποίοι είναι φορείς του αλληλομόρφου KCNJ11 EK.Η μελέτη αυτή ήταν η πρώτη που παρήγαγε πειραματικά δεδομένα υγρής βιοψίας σε συνδυασμό με τη DNA μεθυλίωση, τα οποία αφενός εμπλούτισαν τη γνώση μας για τη βιολογία του ccfDNA στον ΣΔΤ2, αφετέρου ανέδειξαν νέες παραμέτρους με πιθανή κλινική αξία. Συγκεκριμένα, ήταν η πρώτη μελέτη που διερεύνησε και χρησιμοποίησε τη διαφορική μεθυλίωση β-κυτταροειδικών γονιδίων στο ccfDNA για την ανάπτυξη μιας παγκρεατικής β-κυτταρικής υπογραφής με μεγάλη κλινική αξία στον ΣΔ. Η επικύρωση σε μεγαλύτερο αριθμό δειγμάτων ασθενών με ΣΔ, καθώς και σε προοπτικά συλλεγμένα δείγματα δύναται να αναδείξουν περαιτέρω την κλινική αξία της υπογραφής στην έγκαιρη διάγνωση, ανίχνευση και παρακολούθηση αυτής της σημαντικής νοσολογικής οντότητας. Ακόμη, η μελέτη αυτή ήταν η πρώτη που αξιολόγησε την επίδραση της μεθυλίωσης στους υποκινητές γονιδίων-στόχων σχετικών με την θεραπεία του ΣΔΤ2. Επιπλέον, τα ευρήματα μας ανοίγουν τον δρόμο για ανάλογες μελέτες σε μεγαλύτερους πληθυσμούς ασθενών με αυξημένη κλινική βαρύτητα.

Sign in / Sign up

Export Citation Format

Share Document