Quantification of Field Resistance to Verticillium dahliae in Eight Russet-Skinned Potato Cultivars Using Real-Time PCR

An increase in the stringency for higher quality potato tubers and restrictions on the use of soil fumigants, among other factors, has garnered renewed interest in Verticillium wilt, particularly in russet-skinned cultivars grown for processing. In response to the needs of producers, breeders have increased efforts in the development of potato cultivars with resistance to Verticillium dahliae Kleb., the primary cause of Verticillium wilt. These efforts have resulted in the release of numerous russet-skinned cultivars with purported resistance to the pathogen. However, because efficient and effective methods to screen germplasm for true resistance do not exist, breeders typically have reported resistance based on the development of wilt symptoms alone. The studies reported here demonstrate the efficiency and practicality of a QPCR method for quantification of V. dahliae in potato stem tissue. This method, developed to detect the target trypsin protease gene of the pathogen, was compared with traditional methods for V. dahliae quantification which involve plating stem tissue or sap onto semi-selective media, as well as to a recently developed QPCR assay which amplifies a region of the β-tubulin gene of V. dahliae. The QPCR assay developed in the studies reported here was demonstrated to be sensitive to 0.25 pg of DNA. Use of the duplex real-time PCR assay, utilizing the potato actin gene to normalize quantification, resulted in clearer differentiation of levels of resistance among eight russet-skinned potato cultivars inoculated in greenhouse trials when compared with traditional plating assays. However, relative levels of resistance among cultivars were similar between traditional plating and QPCR methods, resulting in correlation coefficients greater than 0.93. The assay described here also detected the pathogen in inoculated stem tissue at higher frequencies than both traditional plating assays and a previously developed QPCR assay. The QPCR assay developed here demonstrates rapid, efficient, and accurate quantification of V. dahliae, providing a tool amenable for use by breeding programs on large numbers of clones and selections, and will aid researchers evaluating other control strategies for Verticillium wilt.

Download Full-text

Erratum: Evaluation of Polymerase Chain Reaction (PCR)-Based Methods for Rapid, Accurate Detection and Monitoring of Verticillium dahliae in Woody Hosts by Real-Time PCR

Plant Disease ◽

10.1094/pdis-05-14-0528.1-re ◽

2015 ◽

Vol 99 (10) ◽

pp. 1452-1452

Keyword(s):

Polymerase Chain Reaction ◽

Real Time ◽

Verticillium Dahliae ◽

Real Time Pcr ◽

Chain Reaction ◽

Accurate Detection ◽

Polymerase Chain

Download Full-text

A robust method for identification and in-planta detection of Verticillium dahliae in the infected olive trees, using real-time PCR and nested PCR

Physiological and Molecular Plant Pathology ◽

10.1016/j.pmpp.2020.101559 ◽

2020 ◽

Vol 112 ◽

pp. 101559

Author(s):

Seyed Ali Mousavi ◽

Mojtaba Keykhasaber ◽

Leila Fahmideh ◽

Mehdi Aran

Keyword(s):

Real Time ◽

Verticillium Dahliae ◽

Real Time Pcr ◽

Nested Pcr ◽

Robust Method ◽

In Planta ◽

Olive Trees

Download Full-text

Development of an Assay for Rapid Detection and Quantification of Verticillium dahliae in Soil

Phytopathology ◽

10.1094/phyto-05-11-0130 ◽

2012 ◽

Vol 102 (3) ◽

pp. 331-343 ◽

Cited By ~ 99

Author(s):

Guillaume J. Bilodeau ◽

Steven T. Koike ◽

Pedro Uribe ◽

Frank N. Martin

Keyword(s):

Real Time ◽

Verticillium Dahliae ◽

Internal Control ◽

Real Time Pcr ◽

Pcr Amplification ◽

Intergenic Spacer ◽

Single Copy ◽

Taqman Assay ◽

Wide Range ◽

Pathogen Populations

Verticillium dahliae is responsible for Verticillium wilt on a wide range of hosts, including strawberry, on which low soil inoculum densities can cause significant crop loss. Determination of inoculum density is currently done by soil plating but this can take 6 to 8 weeks to complete and delay the grower's ability to make planting decisions. To provide a faster means for estimating pathogen populations in the soil, a multiplexed TaqMan real-time polymerase chain reaction (PCR) assay based on the ribosomal DNA (rDNA) intergenic spacer (IGS) was developed for V. dahliae. The assay was specific for V. dahliae and included an internal control for evaluation of inhibition due to the presence of PCR inhibitors in DNA extracted from soil samples. An excellent correlation was observed in regression analysis (R2 = 0.96) between real-time PCR results and inoculum densities determined by soil plating in a range of field soils with pathogen densities as low as 1 to 2 microsclerotia/g of soil. Variation in copy number of the rDNA was also evaluated among isolates by SYBR Green real-time PCR amplification of the V. dahliae-specific amplicon compared with amplification of several single-copy genes and was estimated to range from ≈24 to 73 copies per haploid genome, which translated into possible differences in results among isolates of ≈1.8 cycle thresholds. Analysis of the variation in results of V. dahliae quantification among extractions of the same soil sample indicated that assaying four replicate DNA extractions for each field sample would provide accurate results. A TaqMan assay also was developed to help identify colonies of V. tricorpus on soil plates.

Download Full-text

A Real-Time PCR Assay for Detection and Quantification of Verticillium dahliae in Spinach Seed

Phytopathology ◽

10.1094/phyto-10-11-0280 ◽

2012 ◽

Vol 102 (4) ◽

pp. 443-451 ◽

Cited By ~ 36

Author(s):

Dechassa Duressa ◽

Gilda Rauscher ◽

Steven T. Koike ◽

Beiquan Mou ◽

Ryan J. Hayes ◽

...

Keyword(s):

Real Time ◽

Verticillium Wilt ◽

Verticillium Dahliae ◽

Real Time Pcr ◽

The United States ◽

Infected Seed ◽

Polymerase Chain ◽

Reliable Quantification ◽

Pathogen Dna ◽

Detection And Quantification

Verticillium dahliae is a soilborne fungus that causes Verticillium wilt on multiple crops in central coastal California. Although spinach crops grown in this region for fresh and processing commercial production do not display Verticillium wilt symptoms, spinach seeds produced in the United States or Europe are commonly infected with V. dahliae. Planting of the infected seed increases the soil inoculum density and may introduce exotic strains that contribute to Verticillium wilt epidemics on lettuce and other crops grown in rotation with spinach. A sensitive, rapid, and reliable method for quantification of V. dahliae in spinach seed may help identify highly infected lots, curtail their planting, and minimize the spread of exotic strains via spinach seed. In this study, a quantitative real-time polymerase chain reaction (qPCR) assay was optimized and employed for detection and quantification of V. dahliae in spinach germplasm and 15 commercial spinach seed lots. The assay used a previously reported V. dahliae-specific primer pair (VertBt-F and VertBt-R) and an analytical mill for grinding tough spinach seed for DNA extraction. The assay enabled reliable quantification of V. dahliae in spinach seed, with a sensitivity limit of ≈1 infected seed per 100 (1.3% infection in a seed lot). The quantification was highly reproducible between replicate samples of a seed lot and in different real-time PCR instruments. When tested on commercial seed lots, a pathogen DNA content corresponding to a quantification cycle value of ≥31 corresponded with a percent seed infection of ≤1.3%. The assay is useful in qualitatively assessing seed lots for V. dahliae infection levels, and the results of the assay can be helpful to guide decisions on whether to apply seed treatments.

Download Full-text

First report on the detection and quantification of Verticillium dahliae from Estonian strawberry fields using quantitative real-time PCR

Zemdirbyste-Agriculture ◽

10.13080/z-a.2016.103.015 ◽

2016 ◽

Vol 103 (1) ◽

pp. 115-118

Author(s):

Seyed Mahyar Mirmajlessi ◽

Inmaculada Larena ◽

Marika Mänd ◽

Evelin Loit

Keyword(s):

Real Time ◽

Verticillium Dahliae ◽

Real Time Pcr ◽

Quantitative Real Time Pcr ◽

First Report ◽

Detection And Quantification

Download Full-text

A Quantative Real-Time PCR of Phytophthora infestans in different Indian potato cultivars

IOSR Journal of Agriculture and Veterinary Science ◽

10.9790/2380-0441726 ◽

2013 ◽

Vol 4 (4) ◽

pp. 17-26 ◽

Cited By ~ 2

Author(s):

Touseef Hussai ◽

Keyword(s):

Phytophthora Infestans ◽

Real Time ◽

Real Time Pcr ◽

Potato Cultivars ◽

Indian Potato Cultivars

Download Full-text

Assessment of real-time PCR as a method for determining the presence of Verticillium dahliae in different Solanaceae cultivars

European Journal of Plant Pathology ◽

10.1007/s10658-007-9134-8 ◽

2007 ◽

Vol 118 (3) ◽

pp. 199-209 ◽

Cited By ~ 37

Author(s):

Carmen Gayoso ◽

Oscar Martínez de Ilárduya ◽

Federico Pomar ◽

Fuencisla Merino de Cáceres

Keyword(s):

Real Time ◽

Verticillium Dahliae ◽

Real Time Pcr

Download Full-text

Η επίδραση της επιγενετικής κληρονομικότητας στην βιολογική αντιμετώπιση του μύκητα Verticillium dahliae

10.12681/eadd/46838 ◽

2019 ◽

Author(s):

Δανάη Γκίζη

Keyword(s):

Arabidopsis Thaliana ◽

Real Time ◽

Verticillium Dahliae ◽

Real Time Pcr ◽

Paenibacillus Alvei

Επιγενετικές τροποποιήσεις που προκαλούνται από βιοτικές ή αβιοτικές καταπονήσεις δύνανται να επηρεάσουν σημαντικά την έκφραση γονιδίων που σχετίζονται με την άμυνα των φυτών εναντίον παθογόνων μικροοργανισμών. Η επιγενετική κληρονομικότητα αναφέρεται στη διατήρηση ορισμένων εξ’ αυτών των τροποποιήσεων στην επόμενη γενεά. Το αντικείμενο της συγκεκριμένης διατριβής είναι η μελέτη του μηχανισμού μέσω του οποίου ένα ωφέλιμο για τα φυτά βακτήριο το Paenibacillus alvei K165 προσδίδει κληρονομούμενη ανθεκτικότητα εναντίον του φυτοπαθογόνου μύκητα Verticillium dahliae, μέσω της εφαρμογής του σε μητρικά φυτά Arabidopsis thaliana, το οποίο επιβεβαιώθηκε και με ενδοφυτική ποσοτικοποίηση του μύκητα. Πραγματοποιήθηκαν μεταγραφωμικές και μεταβολομικές αναλύσεις στο υπέργειο μέρος φυτών στα οποία εφαρμόστηκε το στέλεχος Κ165 καθώς και των απογόνων τους ώστε να μελετηθεί η ανθεκτικότητά τους εναντίον του μύκητα Verticillium dahliae. Τα αποτελέσματα της μεταγραφωμικής ανάλυσης κατέδειξαν έναν σημαντικό αριθμό γονιδίων με ρόλο στο μονοπάτι βιοσύνθεσης φαινυλοπροπανοειδών των οποίων η έκφραση επηρεάζεται σημαντικά τόσο στα ίδια τα φυτά που εφαρμόστηκε το στέλεχος Κ165 όσο και στους απογόνους τους. Επίσης φαίνεται πως τόσο το μονοπάτι του σαλικυλικού οξέος όσο και αυτό του ιασμονικού/αιθυλενίου ενεργοποιούνται μέσω της εφαρμογής του στελέχους Κ165. Οι μεταβολομικές αναλύσεις έδειξαν σαφή διαφοροποίηση των μεταβολομικών προφίλ των εφαρμογών που ελέχθησαν καθώς και αύξηση του μεταβολισμού των λιπιδίων στα φυτά που δέχθηκαν την εφαρμογή του στελέχους Κ165 και στους απόγονους τους. Για επιβεβαίωση των αποτελεσμάτων της μεταγραφομικής ανάλυσης πραγματοποιήθηκε μελέτη της έκφρασης ενός σημαντικού αριθμού γονιδίων των οποίων η έκφραση φάνηκε ότι επηρεάζεται τόσο στα ίδια τα φυτά που εφαρμόστηκε το στέλεχος Κ165 όσο και στους απογόνους τους. Τα γονίδια που μελετήθηκαν έχουν βασικό ρόλο στην άμυνα των φυτών και συμμετέχουν στα μονοπάτια του σαλικυλικού οξέος, του ιασμονικού/αιθυλενίου και της βιοσύνθεσης φαινυλοπροπανοειδών. Η μελέτη της έκφρασης των γονιδίων PR1, PR5, NPR1 και PDF1.2 έδειξε πως ενώ τις πρώτες ημέρες από την εφαρμογή του μύκητα υπάρχει ενεργοποίηση και του μονοπατιού του σαλικυλικού οξέος, αργότερα την σκυτάλη φαίνεται να αναλαμβάνει το μονοπάτι ιασμονικού/αιθυλενίου καθώς παρατηρείται σημαντική υπερέκφραση του γονιδίου PDF1.2 στα φυτά που εφαρμόστηκε το βακτήριο. Ωστόσο στους ανθεκτικούς απογόνους παρατηρείται παράλληλη ενεργοποίηση των δύο μονοπατιών. Όσον αφορά στο μονοπάτι βιοσύνθεσης φαινυλοπροπανοειδών φαίνεται πως πράγματι, ένας μεγάλος αριθμός γονιδίων επηρεάζεται σημαντικά στα φυτά που εφαρμόστηκε το στελέχος Κ165 και στους απογόνους αυτών. Ωστόσο, το γονίδιο CAD8 ξεχωρίζει μέσω της σημαντικής υπερέκφρασής του στους ανθεκτικούς απογόνους και το γονίδιο 4CL2 μέσω της μεγάλης υπερέκφρασής του στα φυτά που εφαρμόστηκε το στέλεχος Κ165 ενώ το γονίδιο CCR2 παρουσιάζει μεγάλη υπερέκφραση στους ανθεκτικούς απογόνους και ακόμα μεγαλύτερη στα ίδια τα φυτά στα οποία εφαρμόζεται το βακτήριο. Αντιθέτως ο μύκητας φαίνεται πως μειώνει την έκφραση του συγκεκριμένου γονιδίου. Μετρήθηκε επίσης η συγκέντρωση της λιγνίνης στο υπέργειο μέρος των φυτών με τη χρήση φασματοφωτομετρίας, καθώς πρόκειται για το τελικό προϊόν που παράγεται από την ενεργοποίηση του μονοπατιού βιοσύνθεσης φαινυλοπροπανοειδών στα φυτά. Οι μετρήσεις επιβεβαίωσαν την αυξημένη συσσώρευση λιγνίνης στα φυτά που δέχθηκαν την εφαρμογή του στελέχους Κ165 αλλά και στους απογόνους αυτών. Με τη πραγματοποίηση πειραμάτων παθογένειας σε μεταλλαγμένες σειρές Arabidopsis thaliana μελετήθηκε ο ρόλος των γονιδίων CAD1, CAD6, CAD8 των οποίων η έκφραση φαίνεται να επηρεάζεται σημαντικά στους ανθεκτικούς απογόνους. Τα αποτελέσματα των πειραμάτων παθογένειας επιβεβαίωσαν τον ρόλο των παραπάνω γονιδίων στη πρόκληση του φαινομένου καθώς το στέλεχος Κ165 απέτυχε να προστατέψει τα μεταλλαγμένα φυτά και τους απογόνους τους από τον μύκητα V. dahliae. Η ενδοφυτική ποσοτικοποίηση του μύκητα επίσης έδειξε ότι δεν υπάρχει μείωση της συγκέντρωσης του μύκητα στα φυτά που δέχθηκαν το στέλεχος Κ165 ή στους απογόνους αυτών. Πραγματοποιήθηκαν ακόμα πειράματα ανοσοκατακρίμνησης χρωματίνης και ανοσοαπoτυπώματος κατά western με σκοπό να επιβεβαιωθεί η επιγενετική φύση του φαινομένου μέσω του εντοπισμού κληρονομούμενων επιγενετικών τροποποιήσεων που προκαλεί το στέλεχος Κ165. Τα επίπεδα ακετυλίωσης συνολικά στο γονιδίωμα των ανθεκτικών απογόνων βρέθηκαν αυξημένα σε σχέση με τον μάρτυρα. Χρησιμοποιήθηκαν εξειδικευμένα αντισώματα για τον εντοπισμό ακετυλιώσεων στην ιστόνη 3 και μελετήθηκαν τα επίπεδα ακετυλίωσης των γονιδίων PR1, PR5, PDF1.2, CAD4 και CAD8 στις περιοχές των υποκινητών και στο ανοιχτό πλαίσιο ανάγνωσης με τη χρήση της μεθόδου Real time PCR. Τα επίπεδα ακετυλίωσης στους υποκινητές των γονιδίων PR1, PDF1.2, CAD4 και CAD8 των ανθεκτικών απογόνων βρέθηκαν ιδιαίτερα αυξημένα σε σχέση με τους μάρτυρες. Τέλος, μελετήθηκε ο ρόλος των γονιδίων που είναι υπεύθυνα για την ακετυλίωση των αμινοξέων της ιστόνης 3 στην πρόκληση της επιγενετικά κληρονομούμενης ανθεκτικότητας μέσω πραγματοποίησης πειραμάτων παθογένειας σε μεταλλαγμένες σειρές Arabidopsis thaliana. Τα αποτελέσματα επιβεβαίωσαν τον ρόλο των HAC και HAG ακετυλοτρανσφερασών στη πρόκληση της κληρονομούμενης ανθεκτικότητας από το στέλεχος Κ165 καθώς αυτό απέτυχε να μειώσει τα συμπτώματα που προκαλεί ο μύκητας στα μεταλλαγμένα φυτά που εφαρμόστηκε το βακτήριο και τους απογόνους αυτών. Η ενδοφυτική ποσοτικοποίηση του μύκητα επίσης έδειξε ότι δεν υπάρχει μείωση της συγκέντρωσης του μύκητα στα φυτά που δέχθηκαν το στέλεχος Κ165 ή στους απογόνους αυτών.

Download Full-text