scholarly journals Ανάλυση περιοχών με διαφορική μεθυλίωση σε ανευπλοειδίες

2015 ◽  
Author(s):  
Γεωργία Χριστοπούλου
Keyword(s):  
Next Generation Sequencing ◽  
Next Generation ◽  
Differentially Methylated Regions ◽  
Fetal Dna ◽  
Cell Free Fetal Dna ◽  
Generation Sequencing

Οι επιγενετικές τροποποιήσεις του DNA αποτελούν ευρύ αντικείμενο μελέτης σε ότι αφορά τους μηχανισμούς, το ρόλο τους και τις δυνητικές εφαρμογές τους στην πρόβλεψη, διάγνωση και παρακολούθηση παθολογικών καταστάσεων. Η καλύτερα μελετημένη επιγενετική τροποποίηση είναι η μεθυλίωση του DNA.Η διερεύνηση της γενετικής σύστασης του εμβρύου αποτελεί ένα από τα σημαντικότερα ζητήματα στην προγεννητική διάγνωση. Η διάγνωση ανευπλοειδιών του εμβρύου, με συχνότερη την τρισωμία 21 (σύνδρομο Down), πραγματοποιείται με τη διεξαγωγή του καρυοτύπου του εμβρύου και μεθοδολογίες της μοριακής κυτταρογενετικής μετά από επεμβατική λήψη ιστών του. Τέτοιες διαδικασίες είναι η λήψη χοριονικών λαχνών και η αμνιοπαρακέντηση, ενώ σπανιότερα γίνεται λήψη εμβρυϊκού αίματος. Οι μέθοδοι αυτές συνδέονται με κίνδυνο επιπλοκών στην κύηση και αποβολής του εμβρύου. Για την αποφυγή επιπλοκών, πραγματοποιούνται βιοχημικοί και υπερηχογραφικοί έλεγχοι οι οποίοι οδηγούν σε εκτίμηση του κινδύνου να πάσχει ένα έμβρυο, ωστόσο, η ανιχνευσιμότητά τους δεν είναι αρκετά ικανοποιητική.Η ανακάλυψη της κυκλοφορίας εμβρυϊκών κυττάρων και ελεύθερου εμβρυϊκού DNA (cffDNA, cell free fetal DNA) στο περιφερικό αίμα της εγκύου άνοιξε νέους ορίζοντες για την μη επεμβατική ανίχνευση ανευπλοειδιών. Τα τελευταία χρόνια, οι περισσότερες έρευνες εστιάζουν στη μελέτη του cffDNA μέσω τεχνολογιών αλληλούχησης του DNA (NGS, Next Generation Sequencing) και μελέτης της διαφορικής μεθυλίωσης του DNA μητέρας και εμβρύου. Οι τεχνολογίες οι οποίες βασίζονται σε NGS είναι δυναμικές και έχουν σήμερα κλινική εφαρμογή. Παρουσιάζουν, παρ’ όλα αυτά, σημαντικούς περιορισμούς ορισμένους από τους οποίους θα μπορούσαν οι «επιγενετικές» προσεγγίσεις να υπερκεράσουν.Μια από τις επιγενετικές προσεγγίσεις βασίζεται στις διαφορές μεθυλίωσης μητρικού και εμβρυϊκού DNA (DMRs, Differentially Methylated Regions) στο περιφερικό αίμα της εγκύου και τον εμπλουτισμό του cffDNA με την ανοσοκατακρήμνιση μεθυλιωμένου DNA (MeDIP, Methylation Dependent Immuno Precipitation). Μετά τον εμπλουτισμό του cffDNA με MeDIP ακολουθεί ποσοτική ανίχνευση των περιοχών DMRs με τελικό αποτέλεσμα την ανίχνευση ή όχι τρισωμίας 21 στο έμβρυο. Η μεθοδολογία που αναπτύχθηκε αποδείχθηκε ότι έχει υψηλή ευαισθησία και ειδικότητα ωστόσο, επιδέχεται βελτιώσεων.Στην παρούσα διδακτορική διατριβή μελετήθηκαν τροποποιήσεις σε ορισμένα κομβικά σημεία της μεθοδολογίας, οι οποίες αξιολογήθηκαν για την επίδραση τους στην απόδοση των σταδίων αυτών προκειμένου να ενσωματωθούν σε αυτήν. Επιπλέον, λόγω της κρισιμότητας της διαδικασίας της συλλογής, διατήρησης και μεταφοράς των δειγμάτων μέχρι την ανάλυση, εξετάστηκε η καταλληλότητα της συλλογής δειγμάτων περιφερικού αίματος της εγκύου σε ειδικά σωληνάρια STRECK αντί των συνηθέστερα χρησιμοποιούμενων, τα οποία περιέχουν αντιπηκτικό Κ+/EDTA.Η μελέτη έδειξε ότι η επεξεργασία των δειγμάτων περιφερικού αίματος δεν είναι απαραίτητο να γίνει άμεσα και ότι είναι δυνατή η μεταφορά τους χωρίς ο χρόνος που μεσολαβεί και οι δεδομένες συνθήκες μεταφοράς να είναι καθοριστικές παράμετροι για την καταλληλότητα των δειγμάτων και τη διεξαγωγή ασφαλών συμπερασμάτων. Το στάδιο της ανοσοκατακρήμνισης μεθυλιωμένου DNA είναι ίσως το κρισιμότερο στάδιο της μεθοδολογίας, καθώς είναι σχετικά πολύπλοκο, απαιτεί ακριβείς και λεπτούς χειρισμούς και κατά το οποίο είναι δυνατή η εισαγωγή σφαλμάτων. Η σύμπτυξη των δυο σταδίων επώασης (αντίσωμα-DNA και συμπλόκου Ab-DNA-μαγνητικών σφαιριδίων) ήταν επιτυχής μειώνοντας το χρόνο από 4 σε 3 ώρες, την πολυπλοκότητα και τον κόπο για τους χειρισμούς καθώς και την συνακόλουθη εισαγωγή σφαλμάτων. Η μείωση του όγκου της αντίδρασης ανοσοκατακρήμνισης του μεθυλιωμένου DNA οδήγησε σε αποτελέσματα τα οποία είναι το ίδιο καλά σε σχέση με το αρχικό πρωτόκολλο, επιτρέποντας με αυτόν τον τρόπο την οικονομικότερη διαχείριση της ήδη περιορισμένης ποσότητας του cffDNA, εξασφαλίζοντας τη μεγαλύτερη διαθεσιμότητά του για περεταίρω διερευνήσεις. Η μείωση της ποσότητας του αντισώματος και των μαγνητικών σφαιριδίων ανά αντίδραση ανοσοκατακρήμνισης οδήγησε και αυτή σε αποτελέσματα συγκρίσιμα με αυτά της αρχικής μεθοδολογίας μειώνοντας το κόστος της. Στη συνέχεια διεξήχθη μελέτη της αποτελεσματικότητας και της ευαισθησίας της ανίχνευσης DMRs. Δείχθηκε ότι η τροποποιημένη μεθοδολογία επιτρέπει την αποτελεσματική ανίχνευση των DMRs.Η παρούσα μελέτη έδειξε την επιτυχή βελτιστοποίηση της υπάρχουσας προσέγγισης (MeDIP-qPCR) για την μη επεμβατική ανίχνευση της τρισωμίας 21 από το περιφερικό αίμα της εγκύου. Η μέθοδος είναι υποσχόμενη, με δυνατότητα επέκτασης σε περισσότερες ανευπλοειδίες ή και άλλες χρωμοσωματικές ανωμαλίες. Είναι σημαντική η διερεύνηση παραμέτρων για την περαιτέρω βελτιστοποίηση της προκειμένου να είναι εφικτή η μελέτη της γενετικής σύστασης του εμβρύου με επιγενετικές προσεγγίσεις.

scholarly journals Validation of Extensive Next-Generation Sequencing Method for Monogenic Disorder Analysis on Cell-Free Fetal DNA

2019 ◽  
Vol 21 (4) ◽  
pp. 572-579 ◽  
Author(s):  
Claudio Dello Russo ◽  
Anthony Cesta ◽  
Salvatore Longo ◽  
Maria A. Barone ◽  
Antonella Cima ◽  
...  
Keyword(s):  
Next Generation Sequencing ◽  
Next Generation ◽  
Monogenic Disorder ◽  
Fetal Dna ◽  
Sequencing Method ◽  
Cell Free Fetal Dna ◽  
Generation Sequencing ◽  
Next Generation Sequencing Method

Zellfreie fetale DNA im mütterlichen Blut: neue Möglichkeiten in der pränatalen Diagnostik/Cell free fetal DNA in maternal blood: new possibilities in prenatal diagnosis

2012 ◽  
Vol 36 (5) ◽  
Author(s):  
Markus Stumm ◽  
Rolf-Dieter Wegner ◽  
Wera Hofmann
Keyword(s):  
Prenatal Diagnosis ◽  
Next Generation Sequencing ◽  
De Novo ◽  
Maternal Blood ◽  
Fetal Dna ◽  
Cell Free Fetal Dna ◽  
Next Generation Sequencing Ngs ◽  
Fetale Dna ◽  
Generation Sequencing ◽  
Zellfreie Fetale Dna

ZusammenfassungDie zellfreie fetale DNA (cff-DNA) im mütterlichen Blut bietet viele neue Möglichkeiten der pränatalen genetischen Diagnostik. Im Gegensatz zu den etablierten invasiven Techniken der Chorionzottenbiopsie (CVS) und der Amniozentese (AC), die beide mit einem spezifischen Risiko (0,5–1%) einer eingriffsbedingten Fehlgeburt einhergehen, ist die Grundlage für die Gewinnung der cff-DNA eine einfache venöse Blutentnahme der Mutter, die keinerlei Risiko für den Embryo oder Feten darstellt. Damit bietet die cff-DNA die Möglichkeit einer risikofreien genetischen Diagnostik von bestehenden Schwangerschaften. Molekulargenetische Techniken werden schon seit längerer Zeit zum qualitativen Nachweis von spezifischen fetalen Sequenzen, wie paternal vererbten oder neu entstandenen (de novo) Mutationen, eingesetzt. Durch den Einsatz digitaler PCR und Next-Generation-Sequencing (NGS) Technologien gelingt mittlerweile aber auch der sichere quantitative Nachweis von mutierten Allelen sowie von klinisch relevanten Aneuploidien (Trisomie 13, 18 und 21) aus fetaler DNA im mütterlichen Blut.

Towards the Development of a Noninvasive Prenatal Test for Beta-Thalassemia: Utilization of Probe Capture Enrichment and Next Generation Sequencing

Blood ◽  
2016 ◽  
Vol 128 (22) ◽  
pp. 3622-3622 ◽  
Author(s):  
Katie Carlberg ◽  
Nikhil Bose ◽  
Jingyi Deng ◽  
Ashutosh Lal ◽  
Henry Erlich ◽  
...  
Keyword(s):  
Next Generation Sequencing ◽  
Globin Gene ◽  
Maternal Plasma ◽  
Paternal Allele ◽  
Next Generation ◽  
Mixture Ratio ◽  
Minor Fraction ◽  
Cell Free Fetal Dna ◽  
Generation Sequencing ◽  
Fetal Genotype

Abstract β-thalassemia causes significant morbidity and mortality worldwide. Currently, the diagnosis can be made prenatally for couples at risk using invasive procedures such as chorionic villus sampling and amniocentesis. Noninvasive prenatal testing (NIPT) on maternal blood samples would enable earlier fetal diagnosis and eliminate risks associated with these procedures. The discovery of cell-free fetal DNA (cfFDNA) in maternal plasma and advances in next generation sequencing (NGS) have made NIPT a clinical reality for aneuploidies. Diagnosing autosomal recessive (AR) disorders is more challenging as it requires determination of both the paternally and maternally inherited alleles and can be particularly difficult when both parents carry the same mutation. Previous studies used methods to identify the paternally inherited allele in maternal plasma through the detection of a DNA sequence variant present in the father and absent in the mother. Our method expands the target region beyond the β-globin gene into highly polymorphic regions to increase the likelihood of identifying unique paternal sequences. Unlike the detection of the paternal allele, there is no direct qualitative approach for determining the maternally inherited allele. Our solution is an indirect quantitative method that compares the ratio of allelic sequence reads to infer which maternal allele was inherited by the fetus. We have developed a novel NGS assay which utilizes probe capture enrichment, a method employing thousands of short overlapping oligonucleotide probes complementary to a target sequence region. This design makes it uniquely applicable to short, fragmented DNA, such as cell-free DNA (~150 base pairs). Our probe assay targets a contiguous 900 bp region which spans a portion of the β-globin gene (part of exon 2 as well as the entirety of IVS-1 and exon 1) and extends 579 bp into the highly polymorphic 5' UTR region to identify linked sequence variations. Additionally, the assay targets 451 single nucleotide polymorphisms (SNPs) throughout the genome. SNPs that are "informative" (i.e. an allele present in the fetus and absent in the mother) are used to calculate the fraction of cfDNA from the fetus. We have evaluated our assay's performance in a set of experiments designed to simulate the challenging aspects of cfFDNA: very low quantity and short fragment size. The assay's sensitivity was tested by preparing libraries containing amounts of DNA ranging from 50 to 0.05 ngs. At DNA amounts as low as 5 ng (5-fold lower than that expected in plasma), 100% coverage was achieved for the targeted β-globin region and SNPs. The probe/NGS system successfully captured and sequenced DNA fragments as short as 35 bps and as little as 0.5 ng of DNA with >95% coverage. To test the ability of the probe/NGS system to resolve mixtures, DNA samples from patients with known β-globin mutations were combined in ratios ranging from 2.5:97.5 to 20:80 in 25 ng total DNA to mimic the maternal/fetal cfDNA mixture. Our assay was able to detect minority heterozygous mutant alleles at proportions as low as 1.25% and 0.3 ng of DNA. In a mixture designed to simulate a case with a shared parental mutation (CD41/42(-TTCT)), we identified a linked SNP (rs713040) allele, which was within 250 bp of the mutation and unique to the minor fraction. We used this SNP to distinguish the CD41/42 (-TTCT) mutation contributed by the minor fraction. Based on 6 mixtures, we observed 24.3% (110/451) of SNPs to be informative, allowing for a precise estimate of the minor fraction. We estimated the minor fraction to be 11.88% and 5.98% compared to the expected 10% and 5%, respectively. To show proof of concept for inferring the minor ("fetal") genotype when the major ("maternal") genotype was heterozygous mutant (IVS1-5 (G>C)), the estimated minor fraction (10.4% based on 104 informative SNPs) was used to calculate the expected allelic ratios of the 3 different possible minor ("fetal") genotypes. The minor genotype was correctly inferred as wt/wt based on the observed mixture ratio (42.56/57.41 mut/wt) compared to the expected (44.93/55.07). These data show that our probe capture/NGS system can overcome the challenges implicit in the analysis of cfFDNA for NIPT: low DNA amount (<5 ng) and short fragments (<150 bp). We expect that our approach using the fetal fraction estimate will allow us to successfully infer the fetal genotype when applied to maternal plasma. Disclosures Erlich: Allen and Overy, Law Office: Consultancy.

scholarly journals Noninvasive prenatal detection of trisomy: a review of methods and comparison of approaches

2019 ◽  
pp. 39-46
Author(s):  
Е.И. Суркова ◽  
А.Г. Никитин ◽  
А.Н. Тороповский
Keyword(s):  
Clinical Practice ◽  
Next Generation Sequencing ◽  
Prenatal Testing ◽  
Digital Analysis ◽  
Single Nucleotide ◽  
Parallel Sequencing ◽  
Non Invasive ◽  
Fetal Dna ◽  
Cell Free Fetal Dna ◽  
Generation Sequencing

Неинвазивное пренатальное тестирование (НИПТ, Non-Invasive Prenatal Testing, NIPT) с целью выявления трисомий в последнее время получило широкое распространение в клинической практике во многих странах, включая Россию. Несмотря на то, что НИПТ не позволяет оценить количество и структуру всех хромосом плода (это возможно только путём кариотипирования), этот анализ обладает хорошими показателями чувствительности и специфичности, а также позволяет устранить риски, сопровождающие инвазивные диагностические процедуры (амниоцентез, кордоцентез, биопсия ворсин хориона и т.д.). Для НИПТ преимущественно используют последовательности внеклеточной фетальной ДНК (cell-free fetal DNA, cffDNA), которые в небольшой концентрации присутствуют в крови беременной женщины и исчезают после беременности. В настоящее время для НИПТ используют методы высокопроизводительного секвенирования (Next Generation Sequencing, NGS). В обзоре приведены основные подходы и методы, применяемые для НИПТ с целью обнаружения трисомий: массовое параллельное секвенирование методом дробовика (massive parallel shotgun sequencing, MPSS), таргетное массовое параллельное секвенирование (targeted massive parallel sequencing, t-MPS) и подходы, основанные на изучении однонуклеотидных полиморфизмов (single nucleotide polymorphism, SNP), а также произведено сравнение эффективности их использования для выявления трисомий по хромосомам 13, 18 и 21 (синдромов Патау, Эдвардса и Дауна, соответственно). При использовании MPSS анализу подвергаются последовательности всего генома, а при t-MPS - только специфические последовательности. В статье обсуждаются также методы анализа мРНК, эпигенетических маркёров плода и дополнительные методы усиления сигнала (например, DANSR, Digital Analysis of Selected Regions, цифровой анализ выбранных областей). В обзоре приведены основные причины появления ложных (ложноположительных и ложноотрицательных) результатов при НИПТ (мозаицизм, феномен “резорбция двойни”, низкий уровень cffDNA и др.). Дано краткое описание современного места НИПТ в клинической практике и перспектив включения НИПТ в схему пренатального скрининга, а также основных трудностей, ограничивающих более широкое применение технологии НИПТ в клинике. Прежде всего эти трудности связаны со спецификой cffDNA (концентрация, индивидуальные отличия и др.), а также с этическими аспектами (генетический детерминизм, информированное согласие пациентов и др.). Non-invasive prenatal testing (NIPT) of trisomy has recently become widespread in clinical practice in many countries, including Russia. Despite the fact that NIPT does not allow to estimate the number and structure of all chromosomes of the fetus (this is possible only when using karyotyping), this analysis has good sensitivity and specificity indicators, and also allows eliminating the risks accompanying invasive diagnostic procedures (amniocentesis, cordocentesis, chorionic villus biopsy, etc.). The sequences of cell-free fetal DNA (cffDNA), which are present in low concentrations in the blood of a pregnant woman and disappear after pregnancy, are mainly used for NIPT. Currently NIPT uses Next Generation Sequencing methods (NGS). The review presents main approaches and methods used for non-invasive prenatal testing of trisomy: massive parallel sequencing by the shotgun method (MPSS), targeted parallel sequencing (t-MPS) and approaches based on the study of single nucleotide polymorphisms (SNP). In review we also compare efficacy of their use for the detection of trisomy of chromosomes 13, 18 and 21 (Patau syndrome, Edwards syndrome and Down syndrome, respectively). When using MPSS, sequences of the whole genome are analyzed, and with t-MPS, only specific sequences of interest are analyzed. The article also discusses methods for analyzing mRNA, fetal epigenetic markers, and additional signal amplification methods (for example, DANSR, Digital Analysis of Selected Regions). The review presents the main reasons for the appearance of false (false positive and false negative) results in NIPT (mosaicism, the phenomenon of “twin resorption”, low levels of fetal DNA, etc.). A brief description of the current place of NIPT in clinical practice and prospects for the inclusion of NIPT in the prenatal screening scheme, as well as the main difficulties that limit the wider use of NIPT technology in the clinic, are given. Primarily, these difficulties are associated with the specificity of cell-free fetal DNA (concentration, individual differences, etc.), as well as ethical issues (genetic determinism, informed patient consent, etc.).

scholarly journals Detection of Microdeletion 22q11.2 in a Fetus by Next-Generation Sequencing of Maternal Plasma

2012 ◽  
Vol 58 (7) ◽  
pp. 1148-1151 ◽  
Author(s):  
Taylor J Jensen ◽  
Zeljko Dzakula ◽  
Cosmin Deciu ◽  
Dirk van den Boom ◽  
Mathias Ehrich
Keyword(s):  
Next Generation Sequencing ◽  
22Q11.2 Deletion Syndrome ◽  
Maternal Plasma ◽  
Deletion Syndrome ◽  
Sequencing Analysis ◽  
Next Generation ◽  
22Q11.2 Deletion ◽  
Fetal Dna ◽  
Chromosome 22Q11.2 ◽  
Generation Sequencing

Abstract BACKGROUND Efforts have been undertaken recently to assess the fetal genome through analysis of circulating cell-free (ccf) fetal DNA obtained from maternal plasma. Sequencing analysis of such ccf DNA has been shown to enable accurate prenatal detection of fetal aneuploidies, including trisomies of chromosomes 21, 18, and 13. We sought to extend these analyses to examine subchromosomal copy number variants through the sequencing of ccf DNA. We examined a clinically relevant genomic region, chromosome 22q11.2, the location of a series of well-characterized deletion anomalies that cause 22q11.2 deletion syndrome. METHODS We sequenced ccf DNA isolated from maternal plasma samples obtained from 2 patients with confirmed 22q11.2 deletion syndrome and from 14 women at low risk for fetal chromosomal abnormalities. The latter samples were used as controls, and the mean genomic coverage was 3.83-fold. Data were aligned to the human genome, repetitive regions were removed, the remaining data were normalized for GC content, and z scores were calculated for the affected region. RESULTS The median fetal DNA contribution for all samples was 18%, with the affected samples containing 17%–18% fetal DNA. Using a technique similar to that used for sequencing-based fetal aneuploidy detection from maternal plasma, we detected a statistically significant loss of representation of a portion of chromosome 22q11.2 in both of the affected fetal samples. No such loss was detected in any of the control samples. CONCLUSIONS Noninvasive prenatal diagnosis of subchromosomal fetal genomic anomalies is feasible with next-generation sequencing.

Sign in / Sign up

Export Citation Format

Share Document