scholarly journals Μελέτη του ρόλου των συστατικών του μεταβολικού μονοπατιού της HDL στην παθογένεια της οστεοπόρωσης και της οστεοαρθρίτιδας

2017 ◽  
Author(s):  
Ελένη Καλυβιώτη
Keyword(s):  
Western Blot ◽  
High Density Lipoprotein ◽  
Real Time ◽  
Density Lipoprotein ◽  
High Density ◽  
Rt Pcr ◽  
Knock Out

Εισαγωγή: Πρόσφατα δεδομένα υποδεικνύουν ότι διαταραχές στον λιπιδικό μεταβολισμό επηρεάζουν τη λειτουργία των κυττάρων του οστού με αποτέλεσμα την ανάπτυξη εκφυλιστικών και μεταβολικών νόσων, όπως η οστεοπόρωση (ΟΠ). Η ΟΠ αποτελεί μια κοινή μεταβολική διαταραχή, η οποία χαρακτηρίζεται από μειωμένη οστική μάζα και σταδιακή επιδείνωση της μικροαρχιτεκτονικής δομής του οστίτη ιστού. Επακολούθως, οι ασθενείς που πάσχουν από τη νόσο διατρέχουν αυξημένο κίνδυνο καταγμάτων. Τα τελευταία χρόνια αρκετές μελέτες ανέδειξαν την ύπαρξη μιας ισχυρής σύνδεσης μεταξύ του οστικού και λιπιδικού μεταβολισμού. Επιπλέον, τόσο η ομάδα μας όσο και άλλοι ερευνητές έχουν δείξει ότι διαταραχές στο μεταβολισμό της υψηλής πυκνότητας λιποπρωτεΐνης (High Density Lipoprotein-HDL) ενέχονται στην εμφάνιση μεταβολικών νοσημάτων, όπως είναι η Οστεοαρθρίτιδα (ΟΑ). Γνωρίζοντας τον πολύ σημαντικό ρόλο της HDL στον μεταβολισμό των λιπιδίων στο πλάσμα και στους ιστούς και οδηγούμενοι από τα ευρήματα της δικής μας ομάδας αλλά και άλλων ερευνητών, στην παρούσα διδακτορική διατριβή, μελετήσαμε το ρόλο της απολιποπρωτεΐνης Α1 (APOA1), βασικού συστατικού του μονοπατιού βιοσύνθεσης της HDL, στη ρύθμιση της λειτουργίας των κυττάρων του οστού και στην παθογένεια της οστεοπόρωσης, σε πειραματικά μοντέλα ποντικών.Μεθοδολογία: Για τον λόγο αυτό, χρησιμοποιήσαμε μοντέλα ποντικών με έλλειψη του γονιδίου της ApoA1 (ApoΑ1-/-) και αγρίου τύπου (C57BL/6) (ομάδα ελέγχου). Δύο και επτά ημέρες προ της ευθανασίας πραγματοποιήθηκε ενδοπεριτοναϊκή ένεση καλσεΐνης. Πριν την ευθανασία λήφθηκε πλάσμα αίματος και ακολούθως τα ζώα θυσιάστηκαν. Από τα πειραματόζωα απομονώθηκαν χειρουργικά το μηριαίο οστό και οι οσφυϊκοί σπόνδυλοι, τα οποία χρησιμοποιήθηκαν για ιστολογικές, ιστομορφομετρικές, εμβιομηχανικές και in vitro αναλύσεις. Με τη χρήση microCT scanner εκτιμήθηκε η ποιότητα και η ποσότητα του σπογγώδους και του φλοιώδους οστού (στατική ιστομορφομετρία). Με τη χρώση TRAP και τη χρώση καλσεΐνης (δυναμική ιστομορφομετρία) ελέγχθηκε η οστική αποδόμηση και ο ρυθμός σύνθεσης νεοσχηματιζόμενου οστού, αντίστοιχα. Με τη χρήση φασματοσκοπίας Raman, αξιολογήθηκε η κατάσταση του δικτύου κολλαγόνου των μηριαίων οστών, ενώ αναλύθηκαν και οι εμβιομηχανικές ιδιότητες του οστού (αντοχή σε θραύση, ελαστικότητα κλπ) με τη χρήση του 3-point bending, στις δύο ομάδες πειραματόζωων. Επιπλέον, μεσεγχυματικά κύτταρα (MSC) του μυελού των οστών απομονώθηκαν από το μηριαίο οστό των πειραματόζωων και καλλιεργήθηκαν με σκοπό την εκτίμηση της έκφρασης, τόσο σε επίπεδο πρωτεΐνης όσο και σε επίπεδο mRNA, μορίων που εμπλέκονται στην οστεοβλαστική (RUNX2, OSX, COL1A1) και στην οστεοκλαστική λειτουργία (OPG, RANKL, OPG/RANKL, RANK, TRAP, cathepsin Κ) καθώς και στην λιπογένεση (PPARγ, CEBPA). Επίσης, μελετήθηκε η έκφραση των γονιδίων που εμπλέκονται στο μεταβολικό μονοπάτι της χοληστερόλης (ApoA2, Ggps, Hmgcr, Hdlbp, Fdps1, Cpt1a, Scarb1), αλλά και των γονιδίων που σχετίζονται με τη διατήρηση και την κινητοποίηση των μεσεγχυματικών κυττάρων (Ptprc, Sca-1, Cxcl12, Cxcr4, Anxa2). Για την εκτίμηση των επιπέδων έκφρασης των πρωτεϊνών, χρησιμοποιήσαμε τις μοριακές τεχνικές Western Blot και κυτταρομετρία ροής ενώ για την αξιολόγηση των επιπέδων έκφρασης του mRNA χρησιμοποιήσαμε τη real time RT-PCR. Αποτελέσματα: Η ανάλυση των αποτελεσμάτων έδειξε στατιστικά σημαντική μείωση της οστικής μάζας στα ΑpoΑ1-/- συγκριτικά με τα ποντίκια αγρίου τύπου. Η έκφρασης της ACTH ήταν όμοια και στις δυο ομάδες ζώων, ενώ τα επίπεδα mRNA του Scarb1 ήταν σημαντικά αυξημένα στα ΑpoΑ1-/- ποντίκια. Τα αποτελέσματα της στατικής και δυναμικής ιστομορφομετρίας έδειξαν ότι η μειωμένη οστική μάζα στα ΑpoΑ1-/- ποντίκια αντικατοπτρίζει τη μειωμένη οστική σύνθεση. Η ανάλυση της βιοχημικής σύνθεσης και των εμβιομηχανικών ιδιοτήτων των μηριαίων οστών, έδειξε ότι αυτές οι παράμετροι ήταν διαταραγμένες στα ΑpoΑ1-/- συγκριτικά με τα αγρίου τύπου ποντίκια. Επιπρόσθετα, η επαγωγή διαφοροποίησης των MSC, κάτω από τις ίδιες συνθήκες, από τα ΑpoΑ1-/- ποντίκια φαίνεται να εμφανίζει μειωμένη παραγωγή οστεοβλαστών και αυξημένη παραγωγή λιποβλαστών σε αντίθεση με τα MSC από αγρίου τύπου ποντίκια. Αυτό φανερώνει την ύπαρξη μιας μετατόπισης στην ισορροπία της διαδικασίας διαφοροποίησης των MSC, η οποία ευνοεί την λιπογένεση. Η παρατήρηση αυτή έρχεται σε συμφωνία με την αρχική ιστολογική παρατήρηση της ύπαρξης αυξημένων λιποκυττάρων στο μυελό των οστών των ΑpoΑ1-/- ποντικιών σε σχέση με τα ποντίκια ελέγχου. Αντίθετα με τα ευρήματα για τη δυσλειτουργία των οστεοβλαστών, η οστεοκλαστική διαφοροποίηση in vitro και η μέτρηση της οστεοκλαστικής επιφάνειας in vivo εμφανίζονται ανεπηρέαστες. Επιπρόσθετα, σε ολικά κύτταρα του μυελού των οστών, σε συμφωνία με τα αυξημένα λιποκύτταρα και τα δεσμευμένα προς λιποβλάστες αρχέγονα MSC, τα επίπεδα έκφρασης του PPARγ είναι στατιστικώς σημαντικά αυξημένα στα ΑpoΑ1-/- ποντίκια. Ακόμα, στο μυελό των οστών στα apoΑ1-/- ποντίκια η έκφραση της κυτταροκίνης CXCL12 είναι μειωμένη, ενώ του CXCR4 αυξημένη, στοιχεία που συμφωνούν με μειωμένη σηματοδότηση στο μονοπάτι που εμπλέκεται στη διατήρηση των MSC (homing) και την οστεοβλαστική διαφοροποίηση. Επιπλέον, στα ApoΑ1-/- ποντίκια παρατηρείται σημαντική μείωση στους παράγοντες που σχετίζονται με τη διαφοροποίηση και λειτουργία των οστεοβλαστών, όπως είναι ο RUNX2, ο OSX και ο COL1A1. Ενώ, επίσης τα knock out ποντίκια εμφανίζουν αυξημένη έκφραση του παράγοντα CEPBa, υποδηλώνοντας την ύπαρξη πολύπλοκων αλλαγών στην ανάπτυξη και διαφοροποίηση που απαιτούν περαιτέρω διερεύνηση.Συμπεράσματα: Η έλλειψη της APOA1 οδηγεί σε ελάττωση της οστικής μάζας, κυρίως λόγω μειωμένης λειτουργίας των οστεοβλαστών. Επιπλέον, η έλλειψη της APOA1 οδηγεί σε αύξηση της λιπογένεσης και μείωση της οστεοβλαστογένεσης, η οποία με τη σειρά της οδηγεί σε ελαττωματική σύνθεση οστού, ενώ παράλληλα η δράση των οστεοκλαστών παραμένει ανεπηρέαστη. Τα αποτελέσματα μας, για πρώτη φορά, αναδεικνύουν ότι η APOA1 ρυθμίζει τη λειτουργία των οστεοβλαστών και των λιποβλαστών και αυξάνει την πιθανότητα ότι η APOA1 μπορεί να δράσει ως πιθανός θεραπευτικός στόχος για τη θεραπεία της οστεοπόρωσης και άλλων μεταβολικών νοσημάτων.

Rapid transformation of [3H]cholesteryl ester m rat high-density lipoprotein: in vivo and in vitro studies

Steroids ◽  
1990 ◽  
Vol 55 (7) ◽  
pp. 308-313
Author(s):  
I.J. Goldberg ◽  
R.S. Rosenfeld ◽  
I. Paul ◽  
L.K. Miller ◽  
M.L. Tiell
Keyword(s):  
High Density Lipoprotein ◽  
Cholesteryl Ester ◽  
Density Lipoprotein ◽  
High Density ◽  
In Vitro Studies ◽  
Rapid Transformation

Synthesis of recombinant high density lipoprotein with apolipoprotein A-I and apolipoprotein A-V

2011 ◽  
Vol 392 (5) ◽  
Author(s):  
Xinbo Zhang ◽  
Baosheng Chen
Keyword(s):  
High Density Lipoprotein ◽  
Low Density Lipoprotein ◽  
Atherosclerotic Lesion ◽  
Density Lipoprotein ◽  
High Density ◽  
Over Expression ◽  
Apolipoprotein A ◽  
Atherosclerotic Lesion Development

Abstract It has been shown that apolipoprotein A-V (apoA-V) over-expression significantly lowers plasma triglyceride levels and decreases atherosclerotic lesion development. To assess the feasibility of recombinant high density lipoprotein (rHDL) reconstituted with apoA-V and apolipoprotein A-I (apoA-I) as a therapeutic agent for hyperlipidemic disorder and atherosclerosis, a series of rHDL were synthesized in vitro with various mass ratios of recombinant apoA-I and apoA-V. It is interesting to find that apoA-V of rHDL had no effect on lipoprotein lipase (LPL) activation in vitro and very low density lipoprotein (VLDL) clearance in HepG2 cells and in vivo. By contrast, LPL activation and VLDL clearance were inhibited by the addition of apoA-V to rHDL. Furthermore, the apoA-V of rHDL could not redistribute from rHDL to VLDL after incubation at 37°C for 30 min. These findings suggest that an increase of apoA-V in rHDL could not play a role in VLDL clearance in vitro and in vivo, which could, at least in part, attribute to the lost redistribution of apoA-V from rHDL to VLDL and LPL binding ability of apoA-V in rHDL. The therapeutic application of rHDL reconstituted with apoA-V and apoA-I might need the construction of rHDL from which apoA-V could freely redistribute to VLDL.

scholarly journals Clearance from plasma of lymph chylomicrons and chylomicron remnants labelled with 125I-tyramine-cellobiose

1992 ◽  
Vol 286 (3) ◽  
pp. 937-943 ◽  
Author(s):  
H L Ly ◽  
B C Mortimer ◽  
E Baker ◽  
T G Redgrave
Keyword(s):  
High Density Lipoprotein ◽  
Lipoprotein Lipase ◽  
Bovine Milk ◽  
Density Lipoprotein ◽  
High Density ◽  
Low Density ◽  
Apolipoprotein B48 ◽  
Chylomicron Remnants

The aims of the present study were to evaluate the metabolism of chylomicrons (CM) and of CM remnants after labelling with radioactive iodine and converting the iodinated CM into remnants in vitro. Lymph CM were radiolabelled with 125I or sham-labelled with 127I by either the ICl procedure or the tyramine-cellobiose (TC) procedure, then injected into rats. The clearance from plasma of the iodinated CM was compared with control non-iodinated lipid-labelled CM. After iodination with ICl, the plasma removal of endogenously labelled CM was significantly different from non-iodinated CM, with increased uptake of CM triacylglycerols by the liver. In contrast, the clearances from plasma and the uptake by organs of radiolabelled lipids of CM iodinated by the TC method (TC-CM) were similar to control CM. About 40% of the label from 125I-TC-CM was insoluble in 50% propan-2-ol, indicating association with CM apolipoprotein B48. Only about 8% of label was lipid soluble, mostly in phosphatidylethanolamine. Radioactivity from 125I-TC-CM injected intravenously in rats was cleared rapidly and by 30 min only 20% remained in plasma, whereas 48% was recovered in the liver. After fractionation of the plasma by density-gradient ultracentrifugation, most label remained associated with d (relative density) less than 1.006 lipoproteins. In intact rats label was also found associated with the low-density and high-density lipoprotein fractions of plasma. When the liver was excluded from circulation, the recovery of label in low-density- and high-density-lipoprotein fractions was greatly decreased. CM remnants were prepared in vivo by injecting 125I-TC-CM into functionally hepatectomized donors and compared with remnants prepared in vitro by incubation with purified bovine milk lipoprotein lipase. Although remnants prepared in vitro cleared from plasma slower than remnants prepared in vivo, the size, lipid composition and apolipoprotein profile on gradient PAGE of the remnants were similar. We conclude that labelling of CM by the TC method avoided the ‘artefactual’ changes in metabolism seen after labelling by the ICl procedure. CM remnants when prepared in vitro using lipoprotein lipase were found to be similar to those prepared in vivo after injection into functionally hepatectomized rats.

scholarly journals High-density lipoprotein 3 physicochemical modifications induced by interaction with human polymorphonuclear leucocytes affect their ability to remove cholesterol from cells

1996 ◽  
Vol 314 (1) ◽  
pp. 285-292 ◽  
Author(s):  
Anne COGNY ◽  
Véronique ATGER ◽  
Jean-Louis PAUL ◽  
Théophile SONI ◽  
Nicole MOATTI
Keyword(s):  
High Density Lipoprotein ◽  
Cholesterol Efflux ◽  
Density Lipoprotein ◽  
High Density ◽  
Molar Ratio ◽  
Polymorphonuclear Leucocytes ◽  
Partial Loss ◽  
Apo Ai

1. We have recently reported that a short incubation (60 min) in vitro of high-density lipoprotein (HDL) 3 with human polymorphonuclear leucocytes (PMNs) leads to a proteolytic cleavage of apolipoprotein (apo) AII and to a change in the distribution of apo AI isoforms [Cogny, Paul, Atger, Soni and Moatti (1994) Eur. J. Biochem. 222, 965–973]. Since PMNs have been observed to be present in the earliest atherosclerotic lesions for a number of days, we investigated the HDL3 physicochemical modifications induced by in vitro interaction for a long period of time (24 h) with PMNs and the consequences of the changes on the ability of HDL3 to remove cholesterol from cells. 2. The stimulated PMN modification of HDL3 over 24 h resulted in a partial loss of protein with no variation in lipid molar ratio and a loss of 50% of HDL α-tocopherol content. The decrease in total protein was due first to a complete degradation of apo AII, and secondly to a partial loss of apo AI. The apo AI remaining on the particles was in part hydrolysed and the apo AI-1 isoform was completely shifted to the apo AI-2 isoform. These apo changes were accompanied by a displacement of the native HDL3 apparent size toward predominantly larger particles. 3. The ability of PMN-modified HDL3 to remove 3H-labelled free cholesterol from cells was measured in two cell lines: Fu5AH rat hepatoma cells and J774 mouse macrophages. HDL3 which had only a limited contact with PMNs (60 min) showed only a small non-significant reduction in the efficiency of cholesterol efflux. On the other hand, compared with native HDL3, HDL3 modified by PMNs for 24 h had a markedly reduced ability to remove cholesterol from cells, regardless of the type of cell. 4. The results suggest that PMN-modified HDL3, if occurring in vivo, could contribute to acceleration of the atherogenic process by decreasing the cholesterol efflux from cells.

scholarly journals A two-step homogeneous assay for apolipoprotein E-containing high-density lipoprotein-cholesterol

2018 ◽  
Vol 56 (1) ◽  
pp. 123-132 ◽  
Author(s):  
Yuji Takahashi ◽  
Yasuki Ito ◽  
Toshihiro Sakurai ◽  
Norio Wada ◽  
Atsushi Nagasaka ◽  
...  
Keyword(s):  
High Density Lipoprotein ◽  
Apolipoprotein E ◽  
High Density Lipoprotein Cholesterol ◽  
Density Lipoprotein ◽  
High Density ◽  
Lipoprotein Cholesterol ◽  
In Vivo Studies ◽  
Homogeneous Assay

Background Apolipoprotein E-containing high-density lipoprotein shows antiatherogenic properties in vitro. There is a need for a homogeneous assay to determine the concentration of apolipoprotein E-containing high-density lipoprotein for in vivo studies. Methods In the proposed homogeneous assay, lipoproteins other than apolipoprotein E-containing high-density lipoprotein were eliminated in the first step. Apolipoprotein E-containing high-density lipoprotein-cholesterol was measured in the second step. The control study used a 13% polyethylene glycol precipitation assay (control assay). Results The homogeneous assay showed good performance in validation studies. In subjects with normal liver function ( n = 78), a significant correlation was found between the control assay and the homogeneous assay ( r = 0.824). Serum apolipoprotein E-containing high-density lipoprotein cholesterol concentrations, determined by the control assay and the homogeneous assay, respectively, were 0.05 (0.04–0.10) (median [25th–75th percentile]) mmol/L and 0.10 (0.06–0.13) mmol/L for healthy individuals ( n = 12), and 0.03 (0.01–0.13) mmol/L and 0.02 (0.01–0.02) mmol/L for patients with cholestasis ( n = 6). The results indicate that the homogeneous assay recovers cholesterol contained in physiological apolipoprotein E-containing high-density lipoprotein, but not in pathological apolipoprotein E-containing high-density lipoprotein from cholestatic patients. Conclusions The proposed two-step homogeneous assay enables selective measurement of physiological apolipoprotein E-containing high-density lipoprotein cholesterol in common autoanalysers. This assay might uncover a role for apolipoprotein E-containing high-density lipoprotein in physiological conditions.

scholarly journals Antiinflammatory effects of reconstituted high-density lipoprotein during human endotoxemia.

1996 ◽  
Vol 184 (5) ◽  
pp. 1601-1608 ◽  
Author(s):  
D Pajkrt ◽  
J E Doran ◽  
F Koster ◽  
P G Lerch ◽  
B Arnet ◽  
...  
Keyword(s):  
High Density Lipoprotein ◽  
Density Lipoprotein ◽  
High Density ◽  
Double Blind ◽  
Endotoxin Challenge ◽  
Biologically Relevant ◽  
Cytokine Inhibitors ◽  
Enhanced Expression

High-density lipoprotein (HDL) has been found to neutralize LPS activity in vitro and in animals in vivo. We sought to determine the effects of reconstituted HDL (rHDL) on LPS responsiveness in humans in a double-blind, randomized, placebo-controlled, cross-over study. rHDL, given as a 4-h infusion at 40 mg/kg starting 3.5 h before endotoxin challenge (4 ng/kg), reduced flu-like symptoms during endotoxemia, but did not influence the febrile response. rHDL potently reduced the endotoxin-induced release of TNF, IL-6, and IL-8, while only modestly attenuating the secretion of proinflammatory cytokine inhibitors IL-1ra, soluble TNF receptors and IL-10. In addition, rHDL attenuated LPS-induced changes in leukocyte counts and the enhanced expression of CD11b/CD18 on granulocytes. Importantly, rHDL infusion per se, before LPS administration, was associated with a downregulation of CD14, the main LPS receptor, on monocytes. This effect was biologically relevant, since monocytes isolated from rHDL-treated whole blood showed reduced expression of CD14 and diminished TNF production upon stimulation with LPS. These results suggest that rHDL may inhibit LPS effects in humans in vivo not only by binding and neutralizing LPS but also by reducing CD14 expression on monocytes.

Sign in / Sign up

Export Citation Format

Share Document