Subproteomic study of hepatitis C virus replicon reveals Ras-GTPase-activating protein binding protein 1 as potential HCV RC component

Ο καρκίνος του τραχήλου της μήτρας αποτελεί την τέταρτη συχνότερη και πιο θανατηφόρα μορφή καρκίνου στις γυναίκες, παγκοσμίως. Ο εμβολιασμός και ο προληπτικός έλεγχος έχουν μειώσει τα περιστατικά όμως η ασθένεια ευθύνεται για σημαντικό αριθμό θανάτων ενώ η διαθέσιμες θεραπευτικές μέθοδοι επηρεάζουν τη γονιμότητα των ασθενών. Σκοπός της διδακτορικής αυτής διατριβής αποτελεί η χρήση τεχνικών πρωτεωμικής σε συνδυασμό με τη βιοπληροφορική ανάλυση και την ανασκόπηση της βιβλιογραφίας για την ανακάλυψη νέων πρωτεϊνών που σχετίζονται με την παθολογία του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας με στόχο την καλύτερη κατανόηση των μοριακών μηχανισμών που διέπουν το σχηματισμό των δυσπλασιών. Για την επίτευξη του στόχου, χρησιμοποιήθηκαν τέσσερις κυτταρικές σειρές, αντιπροσωπευτικές των συχνότερων μολύνσεων από HPV (HeLa - HPV 18, SiHa - HPV 16), του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας χωρίς μόλυνση από HPV (C33A), καθώς και φυσιολογικών κερατινοκυττάρων του τραχήλου της μήτρας (HCK1T). Η ανάλυση των πρωτεϊνικών εκχυλισμάτων πραγματοποιήθηκε με τη μέθοδο GeLC-MS/MS και προσέφερε ικανοποιητικό αριθμό αναγνωρίσεων (2.500-3.500 πρωτεΐνες ανά κυτταρική σειρά) με πολύ καλή αναπαραγωγιμότητα. Από τη σύγκριση της κάθε κυτταρικής σειράς καρκίνου του τραχήλου της μήτρας με τη τα φυσιολογικά κερατινοκύτταρα προέκυψαν ~800-1.400 διαφορικά εκφραζόμενες πρωτεΐνες, ανά σύγκριση, οι οποίες παρέχουν χρήσιμη πληροφορία για τις μεταβολές στη ρύθμιση των σηματοδοτικών μονοπατιών και των σημαντικών μορίων στον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας. Η βιοπληροφορική ανάλυση των διαφορικά εκφραζόμενων πρωτεϊνών επιβεβαίωσε την ειδικότητα των αναγνωρίσεων και την ακρίβεια των μετρήσεων καθώς τα μοριακά μονοπάτια που εμφάνισαν αλλαγή στη ρύθμισή τους σχετίζονται με τις υψηλές ενεργειακές ανάγκες και τον αυξημένο κυτταρικό κύκλο που είναι γνωστό ότι υφίστανται στα καρκινικά κύτταρα. Για τη διαλογή πρωτεϊνών ενδιαφέροντος για περαιτέρω διερεύνηση επιλέχθηκαν οι 105 διαφορικά εκφραζόμενες πρωτεΐνες που εμφάνισαν κοινή τάση έκφρασης στις τρεις συγκρίσεις (HeLa/HCK1T, SiHa/CK1T και C33A/HCK1T) και μελετήθηκαν ενδελεχώς στη βιβλιογραφία. Οι πρωτεΐνες που δεν είχαν μελετηθεί προηγουμένως στον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας αλλά υπάρχουν δεδομένα για αυτές σε άλλους τύπους καρκίνων με παρόμοια τάση έκφρασης όπως και στην παρούσα μελέτη, είναι συνολικά 21 και αποτελούν τη βάση για περαιτέρω μελέτη και πειράματα. Μάλιστα, μετά από βαθύτερη διερεύνηση, επιλέχθηκαν 7 από αυτές (LIM domain and actin-binding protein 1, Importin subunit alpha-1, Serum paraoxonase/arylesterase 2, Elongation factor 1-alpha 2, Caprin-1, Mitochondrial import receptor subunit TOM34, Ras GTPase-activating protein-binding protein 1) για πειράματα ανοσοϊστοχημείας σε δείγματα τραχήλου από υγιείς και ασθενείς με προκαρκινική δυσπλασία χαμηλής και υψηλής διαφοροποίησης καθώς και με και καρκίνο του τραχήλου της μήτρας, ως συνέχεια της παρούσας διδακτορικής διατριβής. Ακόμη, για τις πρωτεΐνες LIM domain and actin-binding protein 1, Importin subunit alpha-1 και Ras GTPase-activating protein-binding protein 1 έχουν σχεδιαστεί και πειράματα λειτουργικής διερεύνησης. Eν κατακλείδι, αποτελέσματα της παρούσας διδακτορικής διατριβής παρέχουν νέες γνώσεις για τους μοριακούς μηχανισμούς και τους βασικούς ρυθμιστές της καρκινογένεσης του τραχήλου της μήτρας και μπορούν να αποτελέσουν τη βάση για περαιτέρω έρευνες και προσεγγίσεις της βιολογίας συστημάτων και να συμβάλουν στην ανακάλυψη βιοδεικτών και στην αναγνώριση νέων φαρμακευτικών στόχων.

Download Full-text

Nonstructural 5A Protein of Hepatitis C Virus Regulates Soluble Resistance-Related Calcium-Binding Protein Activity for Viral Propagation

Journal of Virology ◽

10.1128/jvi.02493-15 ◽

2015 ◽

Vol 90 (6) ◽

pp. 2794-2805 ◽

Cited By ~ 7

Author(s):

Giao V. Q. Tran ◽

Trang T. D. Luong ◽

Eun-Mee Park ◽

Jong-Wook Kim ◽

Jae-Woong Choi ◽

...

Keyword(s):

Hepatitis C Virus ◽

Hepatitis C ◽

Protein Interaction ◽

Calcium Binding ◽

Crucial Role ◽

Binding Protein ◽

Binding Activity ◽

Calcium Binding Protein ◽

Virus Propagation ◽

Ns5a Protein

ABSTRACTHepatitis C virus (HCV) is a major cause of chronic liver disease and is highly dependent on cellular proteins for virus propagation. To identify the cellular factors involved in HCV propagation, we recently performed protein microarray assays using the HCV nonstructural 5A (NS5A) protein as a probe. Of 90 cellular protein candidates, we selected the soluble resistance-related calcium-binding protein (sorcin) for further characterization. Sorcin is a calcium-binding protein and is highly expressed in certain cancer cells. We verified that NS5A interacted with sorcin through domain I of NS5A, and phosphorylation of the threonine residue 155 of sorcin played a crucial role in protein interaction. Small interfering RNA (siRNA)-mediated knockdown of sorcin impaired HCV propagation. Silencing of sorcin expression resulted in a decrease of HCV assembly without affecting HCV RNA and protein levels. We further demonstrated that polo-like kinase 1 (PLK1)-mediated phosphorylation of sorcin was increased by NS5A. We showed that both phosphorylation and calcium-binding activity of sorcin were required for HCV propagation. These data indicate that HCV modulates sorcin activity via NS5A protein for its own propagation.IMPORTANCESorcin is a calcium-binding protein and regulates intracellular calcium homeostasis. HCV NS5A interacts with sorcin, and phosphorylation of sorcin is required for protein interaction. Gene silencing of sorcin impaired HCV propagation at the assembly step of the HCV life cycle. Sorcin is phosphorylated by PLK1 via protein interaction. We showed that sorcin interacted with both NS5A and PLK1, and PLK1-mediated phosphorylation of sorcin was increased by NS5A. Moreover, calcium-binding activity of sorcin played a crucial role in HCV propagation. These data provide evidence that HCV regulates host calcium metabolism for virus propagation, and thus manipulation of sorcin activity may represent a novel therapeutic target for HCV.

Download Full-text