scholarly journals Effect of using green fluorescent protein double-stranded RNA as non-target negative control in Nasonia vitripennis RNA interference assays

2021 ◽  
Vol 2 ◽  
Author(s):  
Julien Rougeot ◽  
Yidong Wang ◽  
Eveline C. Verhulst
Keyword(s):  
Green Fluorescent Protein ◽  
Rna Interference ◽  
Fluorescent Protein ◽  
Parasitoid Wasp ◽  
Negative Control ◽  
Differentially Expressed ◽  
Nasonia Vitripennis ◽  
Target Control ◽  
Green Fluorescent ◽  
Target Effects

Abstract RNA interference (RNAi) is a technique used in many insects to study gene function. However, prior research suggests possible off-target effects when using Green Fluorescent Protein (GFP) sequence as a non-target control. We used a transcriptomic approach to study the effect of GFP RNAi (GFP-i) in Nasonia vitripennis, a widely used parasitoid wasp model system. Our study identified 3.4% of total genes being differentially expressed in response to GFP-i. A subset of these genes appears involved in microtubule and sperm functions. In silico analysis identified 17 potential off-targets, of which only one was differentially expressed after GFP-i. We suggest the primary cause for differential expression after GFP-i is the non-specific activation of the RNAi machinery at the injection site, and a potentially disturbed spermatogenesis. Still, we advise that any RNAi study involving the genes deregulated in this study, exercises caution in drawing conclusions and uses a different non-target control.

scholarly journals Non-Target Effects of Green Fluorescent Protein (GFP)-Derived Double-Stranded RNA (dsRNA-GFP) Used in Honey Bee RNA Interference (RNAi) Assays

Insects ◽  
2013 ◽  
Vol 4 (1) ◽  
pp. 90-103 ◽  
Author(s):  
Francis Nunes ◽  
Aline Aleixo ◽  
Angel Barchuk ◽  
Ana Bomtorin ◽  
Christina Grozinger ◽  
...  
Keyword(s):  
Green Fluorescent Protein ◽  
Rna Interference ◽  
Honey Bee ◽  
Fluorescent Protein ◽  
Double Stranded Rna ◽  
Green Fluorescent ◽  
Target Effects

scholarly journals Development and Application of a Green Fluorescent Protein Sentinel System for Identification of RNA Interference in Blastomyces dermatitidis Illuminates the Role of Septin in Morphogenesis and Sporulation

2007 ◽  
Vol 6 (8) ◽  
pp. 1299-1309 ◽  
Author(s):  
T. Krajaejun ◽  
G. M. Gauthier ◽  
C. A. Rappleye ◽  
T. D. Sullivan ◽  
B. S. Klein
Keyword(s):  
Green Fluorescent Protein ◽  
Rna Interference ◽  
Gene Silencing ◽  
Rapid Detection ◽  
Target Gene ◽  
Fluorescent Protein ◽  
Yeast Cells ◽  
Blastomyces Dermatitidis ◽  
Dimorphic Fungus ◽  
Green Fluorescent

ABSTRACT A high-throughput strategy for testing gene function would accelerate progress in our understanding of disease pathogenesis for the dimorphic fungus Blastomyces dermatitidis, whose genome is being completed. We developed a green fluorescent protein (GFP) sentinel system of gene silencing to rapidly study genes of unknown function. Using Gateway technology to efficiently generate RNA interference plasmids, we cloned a target gene, “X,” next to GFP to create one hairpin to knock down the expression of both genes so that diminished GFP reports target gene expression. To test this approach in B. dermatitidis, we first used LACZ and the virulence gene BAD1 as targets. The level of GFP reliably reported interference of their expression, leading to rapid detection of gene-silenced transformants. We next investigated a previously unstudied gene encoding septin and explored its possible role in morphogenesis and sporulation. A CDC11 septin homolog in B. dermatitidis localized to the neck of budding yeast cells. CDC11-silenced transformants identified with the sentinel system grew slowly as flat or rough colonies on agar. Microscopically, they formed ballooned, distorted yeast cells that failed to bud, and they sporulated poorly as mold. Hence, this GFP sentinel system enables rapid detection of gene silencing and has revealed a pronounced role for septin in morphogenesis, budding, and sporulation of B. dermatitidis.

scholarly journals Identification of Restriction Factors by Human Genome-Wide RNA Interference Screening of Viral Host Range Mutants Exemplified by Discovery of SAMD9 and WDR6 as Inhibitors of the Vaccinia Virus K1L−C7L− Mutant

mBio ◽  
2015 ◽  
Vol 6 (4) ◽  
Author(s):  
Gilad Sivan ◽  
Pinar Ormanoglu ◽  
Eugen C. Buehler ◽  
Scott E. Martin ◽  
Bernard Moss
Keyword(s):  
Green Fluorescent Protein ◽  
Rna Interference ◽  
Vaccinia Virus ◽  
Host Range ◽  
Human Genome ◽  
Fluorescent Protein ◽  
Restriction Factors ◽  
Genome Wide ◽  
Green Fluorescent ◽  
Viral Host Range

ABSTRACTRNA interference (RNAi) screens intended to identify host factors that restrict virus replication may fail if the virus already counteracts host defense mechanisms. To overcome this limitation, we are investigating the use of viral host range mutants that exhibit impaired replication in nonpermissive cells. A vaccinia virus (VACV) mutant with a deletion of both the C7L and K1L genes, K1L−C7L−, which abrogates replication in human cells at a step prior to late gene expression, was chosen for this strategy. We carried out a human genome-wide small interfering RNA (siRNA) screen in HeLa cells infected with a VACV K1L−C7L−mutant that expresses the green fluorescent protein regulated by a late promoter. This positive-selection screen had remarkably low background levels and resulted in the identification of a few cellular genes, notably SAMD9 and WDR6, from approximately 20,000 tested that dramatically enhanced green fluorescent protein expression. Replication of the mutant virus was enabled by multiple siRNAs to SAMD9 or WDR6. Moreover, SAMD9 and WDR6 clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR)/Cas9 knockout HeLa cell lines were permissive for replication of the K1L−C7L−mutant, in agreement with the siRNA data. Expression of exogenous SAMD9 or interferon regulatory factor 1 restricted replication of the K1L−C7L−mutant in the SAMD9−/−cells. Independent interactions of SAMD9 with the K1 and C7 proteins were suggested by immunoprecipitation. Knockout of WDR6 did not reduce the levels of SAMD9 and interactions of WDR6 with SAMD9, C7, and K1 proteins were not detected, suggesting that these restriction factors act independently but possibly in the same innate defense pathway.IMPORTANCEThe coevolution of microbial pathogens with cells has led to an arms race in which the invader and host continuously struggle to gain the advantage. For this reason, traditional siRNA screens may fail to uncover important immune mechanisms if the pathogens have already developed effective responses. However, host-restricted viral mutants have lost one or more defense genes needed for their replication in nonpermissive cells. By screening human genome libraries of short RNAs that inhibit the expression of individual host genes in nonpermissive cells, we identified SAMD9 and WDR6 as major restriction factors that prevented replication of a vaccinia virus mutant and suggest that host range screening can be generally useful for the investigation of host-pathogen interactions.

scholarly journals Enhanced Gene Silencing in Cells Cured of Persistent Virus Infection by RNA Interference

2010 ◽  
Vol 84 (13) ◽  
pp. 6880-6885 ◽  
Author(s):  
Isabelle Pelletier ◽  
Aure Saulnier ◽  
Cynthia Brisac ◽  
Sophie Jegouic ◽  
Nicolas Vabret ◽  
...  
Keyword(s):  
Green Fluorescent Protein ◽  
Rna Interference ◽  
Virus Infection ◽  
Measles Virus ◽  
Fluorescent Protein ◽  
Small Interfering Rnas ◽  
Rnai Machinery ◽  
Persistent Virus Infection ◽  
Persistent Virus ◽  
Green Fluorescent

ABSTRACT We compared HEp-2-derived cells cured of persistent poliovirus infection by RNA interference (RNAi) with parental cells, to investigate possible changes in the efficiency of RNAi. Lower levels of poliovirus replication were observed in cured cells, possibly facilitating virus silencing by antiviral small interfering RNAs (siRNAs). However, green fluorescent protein (GFP) produced from a measles virus vector and also GFP and luciferase produced from plasmids that do not replicate in human cells were more effectively silenced by specific siRNAs in cured than in control cells. Thus, cells displaying enhanced silencing were selected during curing by RNAi. Our results strongly suggest that the RNAi machinery of cured cells is more efficient than that of parental cells.

scholarly journals Enhanced RNA interference - 1 - like - 1

2015 ◽  
Author(s):  
Γλυκερία Μέρμηγκα
Keyword(s):  
Arabidopsis Thaliana ◽  
Green Fluorescent Protein ◽  
Rna Interference ◽  
Schizosaccharomyces Pombe ◽  
Nicotiana Benthamiana ◽  
Fluorescent Protein ◽  
Green Fluorescent

Οι ριβονουκλεάσες αποτελούν μια ομάδα ενζύμων που συμμετέχουν σε μια πληθώρα διαδικασιών σε όλους τους οργανισμούς από τους ιούς έως τους ανώτερους ευκαρυώτες. Η λήξη της μεταγραφής, η ωρίμανση και επιδιόρθωση των μεταγράφων αλλά και ο μηχανισμός της RNA σίγησης αποτελούν μερικά από τα μονοπάτια στα οποία προεξέχοντα ρόλο επιτελεί αυτή η ομάδα ενζύμων. Ανάλογα με τη θέση δράσης τους πάνω στο υπόστρωμα αλλά και κάποια ιδιαίτερα χαρακτηριστικά τους κατηγοριοποιούνται σε διάφορες οικογένειες μεταξύ των οποίων είναι και η υποοικογένεια Enhancer of RNA interference-1 (ERI-1). Οι πρωτεΐνες τη ομάδας αυτής είναι 3’-5’ εξωριβονουκλεάσες και ανήκουν στην ευρύτερη οικογένεια των DEDDh νουκλεασών, στην οποία μεταξύ άλλων ανήκουν και οι βακτηριακές ολιγοριβονουκλεάση και RNase T. Οι Eri-1 πρωτεΐνες είναι συντηρημένες στους ευκαρυώτες στους οποίους δρα ο μηχανισμός της RNA σίγησης, από το νηματώδη σκώληκα έως το ποντίκι, τον άνθρωπο, τη δροσόφιλα, τον Schizosaccharomyces pombe αλλά και τα φυτά. Συμμετέχουν σε διάφορες διαδικασίες όπως είναι η αποικοδόμηση των μικρών παρεμβαλλόμενων RNA (siRNA), δρώντας κατά αυτόν τον τρόπο στο μονοπάτι της RNA σίγησης, η ωρίμανση και αποικοδόμηση των ιστονικών μεταγράφων αλλά και η ωρίμανση του 5.8S ριβοσωμικού RNA. Το Eri-1 ομόλογο (ERI-1-Like-1, ERIL1) του φυτού Arabidopsis thaliana έχει χλωροπλαστιδιακή στόχευση ενώ φυτά Nicotiana benthamiana που υπερεκφράζουν το διαγονίδιο παρουσιάζουν χλωρωτικούς φαινοτύπους, με χλωροπλάστες που μοιάζουν προπλαστίδια . Από μοριακή ανάλυση των διαγονιδιακών αυτών σειρών προέκυψε ότι τα χλωροπλαστιδιακά μετάγραφα παρουσιάζουν μειωμένα επίπεδα σε σχέση με τα φυτά αγρίου τύπου. Στόχος της παρούσας διατριβής ήταν η περαιτέρω μελέτη της δράσης του Eri-1 ομολόγου στα φυτά (ERI-1-Like-1, ERIL) και συγκεκριμένα στα φυτά-μοντέλα Arabidopsis thaliana και Nicotiana benthamiana. Αρχικά, και λόγω της παρουσίας δύο παραλόγων γονιδίων στο είδος N. benthamiana, κλωνοποιήθηκαν τα μετάγραφα όπου και διαπιστώθηκε ότι από το ένα παράλογο γονίδιο προκύπτουν με εναλλακτικό μάτισμα δύο ισομορφές. Προκειμένου να μελετηθεί η επίδραση του εναλλακτικού ματίσματος στον ενδοκυττάριο εντοπισμό της παραγόμενης πρωτεΐνης, πραγματοποιήθηκαν πειράματα υπερέκφρασης της συγκεκριμένης γονιδιακής θέσης συντηγμένης με την πρωτεΐνη αναφοράς Green Fluorescent Protein, όπου με συνεστιακή μικροσκοπία διαπιστώθηκε ο χλωροπλαστιδιακός εντοπισμός. Η χλωροπλαστιδιακή στόχευση της πρωτεΐνης διαπιστώθηκε και με ανάλυση τύπου western σε πρωτεϊνικά εκχυλίσματα χλωροπλαστών. Επιπλέον, πραγματοποιήθηκε ο χαρακτηρισμός των σειρών που παρουσιάζουν μειωμένα επίπεδα της συγκεκριμένης πρωτεΐνης με αναλύσεις τύπου northern και western. Αυτές οι σειρές μαζί με σειρές υπερέκφρασης του διαγονιδίου οι οποίες είχαν χαρακτηριστεί από προηγούμενες μελέτες αποτέλεσαν τα εργαλεία για τη μελέτη της δράσης της υπό μελέτης πρωτεΐνης. Οι σειρές με έντονη καταστολή παρουσίαζαν μειωμένα επίπεδα χλωροφυλλών σε σχέση με φυτά αγρίου τύπου ενώ από μελέτες ηλεκτρονικής μικροσκοπίας σε τομές φύλλων φυτών N.benthamiana με καταστολή των ERIL1 γονιδίων διαπιστώθηκαν ότι οι χλωροπλάστες παρουσίαζαν παρεκκλίνουσα ανατομία. Από μοριακή ανάλυση τύπου northern φυτών με καταστολή και υπερέκφραση του ERIL1 διαπιστώθηκαν παρεκκλίνοντα πρότυπα στην ωρίμανση των ριβοσωμικών μεταγράφων του χλωροπλάστη υποδεικνύοντας τη συμμετοχή της πρωτεΐνης στην ωρίμανση αυτών των μεταγράφων. Επιπλέον, με ανοσοκατακρήμνιση διαπιστώθηκε ότι η πρωτεΐνη συγκατακρημνίζεται εκτός των ριβοσωμικών μεταγράφων και με ορισμένα άλλα χλωροπλαστιδιακά νουκλεϊκά οξέα υποδεικνύοντας κάποιο πιθανό ρόλο στην ωρίμανση αυτών. Τέλος, με παροδική υπερέκφραση της πρωτεΐνης σε αναπτυγμένα φύλλα N. benthamiana παρατηρήθηκε επίδραση της στην αποικοδόμηση του ώριμου 4.5S rRNA. Τέλος, πραγματοποιήθηκαν πειράματα προκειμένου να μελετηθεί ο ρόλος της υπό μελέτης πρωτεΐνης στο μηχανισμό της RNA σίγησης. Από αυτά δεν διαπιστώθηκε κάποια επίδραση στο μονοπάτια που μελετήθηκαν, ενώ μόνο τα φυτά που υπερεκφράζουν την πρωτεΐνη παρουσίασαν αυξημένα επίπεδα συγκεκριμένων miRNA. Συνολικά, από τα πειράματα της παρούσας μελέτης συμπεραίνεται ότι η πρωτεΐνη ERIL1 δρα στην ωρίμανση των ριβοσωμικών χλωροπλαστιδιακών μεταγράφων και στην αποικοδόμηση του 4.5S rRNA ενώ δεν φαίνεται να έχει κάποιο ρόλο στα μονοπάτια της RNA σίγησης που μελετήθηκαν.

Sign in / Sign up

Export Citation Format

Share Document