Eνήλικα ή σωματικά βλαστικά κύτταρα ορίζονται τα κύτταρα με δυνατότητα ανανέωσης και διαφοροποίησης σε όλους τους κυτταρικούς τύπους ενός ιστού. Είναι σημαντικά για τη φυσιολογική ανανέωση του ιστού και ενεργοποιούνται κατόπιν τραυματισμού του. Σε συγκεκριμένους κυτταρικούς τύπους έχει βρεθεί ότι αποτελούν τα κύτταρα προέλευσης του καρκίνου. Ένα μονοπάτι που εμπλέκεται τόσο στη διατήρηση των βλαστικών κυττάρων όσο και στη διαφοροποίησή τους είναι το μονοπάτι σηματοδότησης Notch. Αποτελεί ένα εξελικτικά συντηρημένο μονοπάτι σε όλα τα μετάζωα, που εμπλέκεται στην εμβρυϊκή ανάπτυξη και την ομοιόσταση των ιστών. Κατά συνέπεια, η δυσλειτουργία ή η απώλεια αυτού του μονοπατιού οδηγεί σε πληθώρα ανθρώπινων ασθενειών, όπως ο καρκίνος. Οι λειτουργίες του στηρίζονται κυρίως στη διασύνδεση γειτονικών κυττάρων που επιτυγχάνεται μέσω της φυσικής επαφής των διαμεμβρανικών υποδοχέων Notch (1-4) και των ομοειδών προσδετών αυτών. Στα θηλαστικά, υπάρχουν 5 προσδέτες: Dll1 (Delta-like 1), Dll3, Dll4, Jagged1 και Jagged2. Η συγκεκριμένη μελέτη επικεντρώνεται στην αξία του Dll1 ως κρίσιμου δείκτη βλαστικών κυττάρων. Πρωταρχικός σκοπός της παρούσας μελέτης είναι η εύρεση επιπρόσθετων δεικτών βλαστικών/προγονικών κυττάρων σε ποικιλία ιστών του ποντικού. Με στόχο τη διερεύνηση του ρόλου του προσδέτη του μονοπατιού Notch, Dll1, στην ανάπτυξη του ποντικού, δημιουργήσαμε ένα διαγονιδιακό «knock-out/knock-in» ποντικό που εκφράζει τη ρεκομπινάση Cre υπό τον έλεγχο του υποκινητή του γονιδίου Dll1. Αξιοποιήσαμε μία επαγόμενη μορφή ρεκομπινάσης, η οποία ενεργοποιείται μόνο μετά από ένεση με Tamoxifen. Με τη βοήθεια του ποντικού Dll1CreERT2, έχουμε χρησιμοποιήσει in vivo και in vitro προσεγγίσεις για να σημάνουμε γενετικά σπάνιους υποπληθυσμούς κυττάρων που εκφράζουν το Dll1 σε διάφορους ιστούς του ενήλικου ποντικού, με έμφαση στο μαστικό αδένα, αλλά και το στόμαχο και το δέρμα, που βρέθηκαν να ανταποκρίνονται στην ογκογόνο σηματοδότηση του KRAS. Προχωρήσαμε σε διασταυρώσεις του ποντικού Dll1CreERT2 με στελέχη επαγόμενης έκφρασης γονιδίου-μάρτυρα. Χρησιμοποιώντας τους διπλά διαγονιδιακούς ποντικούς Dll1CreERT2;Rosa26mTmG, ανιχνεύσαμε Dll1-θετικά κύτταρα σε πολλούς ιστούς, όπως στο μαστικό αδένα, το πάγκρεας, το έντερο, το στόμαχο, το νεφρό, την ουροδόχο κύστη, το ήπαρ, τον σπλήνα και το δέρμα. Η τοπολογία των Dll1θετικών κυττάρων σε πολλούς από αυτούς τους ιστούς είναι συμβατή με τη βιβλιογραφία, ως προς τη θέση που έχει βρεθεί να εδράζονται τα βλαστικά κύτταρα. Για τη διερεύνηση της ανταπόκρισης των Dll1-θετικών κυττάρων σε ογκογόνες μεταλλαγές και την τυχόν συμμετοχή τους ως κύτταρα προέλευσης του καρκίνου, εκφράσαμε μεταλλαγμένα ογκογονίδια ή ογκοκατασταλτικά γονίδια υπό τον έλεγχο του Dll1 υποκινητή. Εντυπωσιακό εύρημα αυτής της σειράς πειραμάτων ήταν οι νεοπλασίες που δημιουργήθηκαν στο δέρμα και τον στόμαχο σε ελάχιστο χρονικό διάστημα από την ένεση με Tamoxifen, δηλαδή από τη στιγμή που εκφράστηκε η μεταλλαγμένη μορφή KRAS(G12D) στα κύτταρα Dll1. Ενεργές μεταλλαγές στο KRAS είναι οι πιο συχνές μεταλλαγές στον καρκίνο του ανθρώπου, κυρίως σε επιθηλιακούς ιστούς. Ιστολογική ανάλυση των νεοπλασιών στον στόμαχο και το δέρμα υπέδειξε πλακώδη υπερπλασία, αλλά όχι διήθηση. Συμπερασματικά, τα σπάνια κύτταρα Dll1 στο πλακώδες επιθήλιο του προστόμαχου, καθώς και του δέρματος, αντιπροσωπεύουν προγονικά κύτταρα που είναι ευαίσθητα στην ογκογόνο δράση του KRAS. Στον στόμαχο, το μοντέλο αυτό αποτελεί ισοδύναμο σύστημα για τον καρκίνο Barrett’s του οισοφάγου του ανθρώπου. Επίσης, στους ποντικούς Dll1CreERT2;KRAS(G12D) παρατηρήθηκαν έντονες υπερπλασίες, είτε απλές είτε άτυπες, στα κύτταρα αυλού των αγωγών του μαστικού αδένα, ένα προκαρκινικό στάδιο του μαστού. Αυτή η παρατήρηση, σε τόσο σύντομο χρονικό διάστημα, συνεισφέρει σημαντικά στο παραπάνω συμπέρασμα, ότι δηλαδή τα κύτταρα Dll1+ είναι τα προγονικά κύτταρα αυλού και αποτελούν τα κύτταρα προέλευσης του καρκίνου του μαστού. Τα κύτταρα που εκφράζουν Dll1 παρουσιάστηκαν ευαίσθητα και στις περιπτώσεις που υπερεκφράσαμε το KRAS, αλλά και τη μεταλλαγμένη μορφή PIK3CAH1047R, μόνο στα Dll1-θετικά κύτταρα. Το γονίδιο PIK3CA είναι το πιο συχνά μεταλλαγμένο γονίδιο στον καρκίνο του μαστού στον άνθρωπο, με εξαίρεση φυσικά το TP53. Πραγματοποιώντας δοκιμασίες Fat Pad (ορθόλογες μεταμοσχεύσεις στο μαστικό αδένα), πειράματα γενεαλογικού εντοπισμού in vivo στο μαστικό αδένα και κλωνογενετικά πειράματα in vitro, συμπεράναμε ότι το Dll1 εκφράζεται τόσο στα μυοεπιθηλιακά κύτταρα όσο και στα κύτταρα αυλού των αγωγών του μαστού. Πιστεύουμε στην ύπαρξη διδύναμων βλαστικών κυττάρων μόνο κατά την εμβρυογένεση, τα οποία εξαφανίζονται κατά την ωρίμανση του μαστικού αδένα και αντικαθίστανται από προγονικά κύτταρα, ειδικά για την κάθε κυτταρική στοιβάδα, που σημαίνονται από το Dll1. Τα κύτταρα αυτά αποτελούν τα κύτταρα που πολλαπλασιάζονται και επεκτείνονται κατά την ανάπτυξη του αδένα, αλλά και κατά τις εγκυμοσύνες. Επίσης, η στατιστικά σημαντική αύξηση των Dll1-θετικών κυττάρων αυλού μετά από πολλαπλές εγκυμοσύνες, μας δείχνει ότι αυτά τα κύτταρα συμβάλλουν στην αναδιαμόρφωση του ιστού μετά από απογαλακτισμό και υποστροφές του. Η στοχευμένη απαλοιφή των Dll1-θετικών κυττάρων οδηγεί σε αδυναμία της κλωνογενετικής ικανότητας του μαστικού αδένα. Μόνο τα Dll1-θετικά μυοεπιθηλιακά κύτταρα είναι ικανά να ανασυστήσουν έναν πλήρως λειτουργικό μαστικό αδένα κατά τις δοκιμασίες Fat Pad. Τέλος, η υπερέκφραση του hN1IC (human Notch 1 Intracellular Domain) στα κύτταρα Dll1 οδηγεί σε πολυκυστική κατάσταση του ήπατος (προκαρκινικό στάδιο πριν το ενδοηπατικό χολαγγειοκαρκίνωμα) μέσα σε διάστημα 6-12 μηνών. Εκκρεμούν πειράματα γενεαλογικού εντοπισμού, καθώς και αναγέννησης του ήπατος, για να ελέγξουμε το ρόλο των κυττάρων Dll1 στο ήπαρ. Στην παρούσα Διδακτορική Διατριβή, καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι τα Dll1-θετικά κύτταρα αποτελούν βλαστικά/προγονικά κύτταρα σε εύρος ιστών του ποντικού, όπως στον στόμαχο, το δέρμα και το μαστικό αδένα. Κατ’ επέκταση, αυτά είναι τα κύτταρα που ανταποκρίνονται σε ογκογόνες μεταλλαγές και αποτελούν τα κύτταρα προέλευσης του καρκίνου στους συγκεκριμένους ιστούς.
Repression of Activator Protein-1-mediated Transcriptional Activation by the Notch-1 Intracellular Domain