scholarly journals Μελέτη της σχέσης δομή - λειτουργία του κύριου μεταφορέα προλίνης (PrnB) στο μύκητα Aspergillus nidulans

2002 ◽  
Author(s):  
Στέφανος Ταβουλάρης
Keyword(s):  
Green Fluorescent Protein ◽  
Amino Acid ◽  
Aspergillus Nidulans ◽  
Fluorescent Protein ◽  
Transmembrane Segments ◽  
Green Fluorescent

Το γονίδιο prnB του μύκητα Aspergillus nidulans κωδικοποιεί ένα ειδικό για την προλίνη μεταφορέα. Ο μεταφορέας αυτός είναι μια διαμεμβρανική πρωτεΐνη με κυτταροπλασματικό αμινοτελικό και καρβοξυτελικό άκρο, που αποτελείται από 12 πιθανά διαμεμβρανικά τμήματα α-έλικας (TMS: Transmembrane segments), τα οποία συνδέονται μεταξύ τους με μικρές υδρόφιλες θηλειές (L: loops). Η πρωτεΐνη PrnB ανήκει στην οικογένεια μεταφορέων APC (Amino Acid Polyamine Organocation) μέλη της οποίας εντοπίζονται σε προκαρυωτικούς και ευκαρυωτικούς οργανισμούς. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή μελετήθηκαν οι σχέσεις δομής-λειτουργίας του μεταφορέα PrnB μέσω της γενετικής, μοριακής και βιοχημικής μελέτης στελεχών του Α. nidulans που εκφράζουν μεταλλαγμένες πρωτεΐνες PrnB. Οι εν λόγω μεταλλαγές είτε απομονώθηκαν γενετικά είτε κατασκευάσθηκαν με in vitro μεταλλαξιγένεση. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι οι παρερμηνεύσιμες μεταλλαγές που επηρεάζουν άμεσα ή έμμεσα τη λειτουργία της πρωτεΐνης PrnB εντοπίζονται στα L2-TMS3 (prnB6, prnB144), TMS6 (prnBKL, prnBKE, prnB119), L6-TMS7 (prnB81), L8-TMS9-L9 (prnB117, prnB206, prnB508) και L10-TMS11 (prnB411) τμήματά της. Από τις παραπάνω μεταλλαγές ιδιαίτερο ρόλο στη λειτουργία της πρωτεΐνης PrnB φαίνεται να διαδραματίζουν τα αμινοξέα Κ245 και F248 του TMS6. Η Κ245 είναι ένα από τα δύο θετικά φορτισμένα αμινοξέα που εντοπίζονται μέσα σε διαμεμβρανικά τμήματα της PrnB ενώ η F248 είναι αυστηρά συντηρημένη σε όλα τα μέλη της οικογένειας APC που είναι καταχωρημένα στην τράπεζα δεδομένων SWISS-PROT. Αλλαγή των αμινοξέων αυτών προκαλεί σημαντική μείωση της χημικής συγγένειας της PrnB για την προλίνη. Επιπλέον, σημαντικό ρόλο στη λειτουργία της PrnB φαίνεται να έχει η περιοχή L8-TMS9, η οποία αντιστοιχεί στη σημαντική για τη λειτουργία μεταφορέων αμινοξέων συναινετική αμφιπαθική περιοχή CAR (Consensus Amphipathic Region). Διπλασιασμός 2 και 3 αμινοξέων στην εν λόγω περιοχή προκαλεί πλήρη απώλεια λειτουργίας και σημαντική μεταβολή των τιμών Km και Vmax της PrnB, αντίστοιχα. Ενδιαφέρον αποτελεί το γεγονός ότι αντίστοιχα με τα παραπάνω τμήματα άλλων μελών της οικογένειας μεταφορέων APC έχει δειχθεί ότι είναι σημαντικά για τη λειτουργία των μεταφορέων αυτών. Εν κατακλείδι, τα παραπάνω αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι οι περιοχές TMS6 και L8-TMS9 του μεταφορέα PrnB αποτελούν μέρος της οδού πρόσδεσης ή/και μεταφοράς της προλίνης διαμέσω της κυτταρικής μεμβράνης. Στα πλαίσια εμβάθυνσης των σχέσεων δομής - λειτουργίας του μεταφορέα PrnB καθώς και για τη μελέτη της in vivo τοπογένεσής του χρησιμοποιήθηκε η πρωτεΐνη GFP (Green Fluorescent Protein). Ένας αριθμός χιμαιρικών γονιδίων prnB - gfp κατασκευάσθηκαν, ενσωματώθηκαν στο γενετικό τόπο του γονιδίου prnB, εκφράστηκαν από το φυσιολογικό παρακινητή του, και τα αντίστοιχα χιμαιρικά μόρια PrnB - GFP εντοπίστηκαν in vivo. Τα χιμαιρικά αυτά μόρια φέρουν 2, 4 ή 8 συνδετικά αμινοξέα μεταξύ των πρωτεϊνών PrnB και GFP. Τα εν λόγω αμινοξέα δεν τροποποιούν τη δευτεροταγή δομή των χιμαιρικών μορίων, καθώς επιλέχθηκαν να μην είναι συμβατά με το σχηματισμό στοιχείων δευτεροταγούς δομής. Βρέθηκε ότι μόνο τα χιμαιρικά μόρια με 4 συνδετικά αμινοξέα είναι πλήρως λειτουργικά στους 25°C (φυσιολογική θερμοκρασία ανάπτυξης του μύκητα). Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι ο αριθμός και το είδος των συνδετικών αμινοξέων μεταξύ των δύο μελών των χιμαιρικών μορίων είναι σημαντικός για τη "φυσιολογική" τοπογένεσή τους στην κυτταρική μεμβράνη. Επιπλέον, η χρήση της πρωτεΐνης GFP για τον in vivo εντοπισμό του διαμεμβρανικού μεταφορέα PrnB είναι δυνατή χωρίς να απαιτείται η υπερέκφραση του τελευταίου. Τέλος, η μέθοδος που αναπτύχθηκε για την κατασκευή χιμαιρικών PrnB-GFP μορίων δίνει τη δυνατότητα ενσωμάτωσης και έκφρασης οποιουδήποτε prnB- αλληλομόρφου. Αυτό έχει ως συνέπεια το διαχωρισμό των μεταλλαγών που επηρεάζουν άμεσα τη λειτουργία της πρωτεΐνης PrnB από αυτές που επηρεάζουν την τοπογένεσή της.

scholarly journals Human Keratinocytes Adopt Neuronal Fates After In Utero Transplantation in the Developing Rat Brain

2021 ◽  
Vol 30 ◽  
pp. 096368972097821
Author(s):  
Andrea Tenorio-Mina ◽  
Daniel Cortés ◽  
Joel Esquivel-Estudillo ◽  
Adolfo López-Ornelas ◽  
Alejandro Cabrera-Wrooman ◽  
...  
Keyword(s):  
Green Fluorescent Protein ◽  
Fluorescent Protein ◽  
Ectopic Expression ◽  
Neural Induction ◽  
Human Keratinocytes ◽  
Differentiation Potential ◽  
Neuronal Proteins ◽  
Green Fluorescent

Human skin contains keratinocytes in the epidermis. Such cells share their ectodermal origin with the central nervous system (CNS). Recent studies have demonstrated that terminally differentiated somatic cells can adopt a pluripotent state, or can directly convert its phenotype to neurons, after ectopic expression of transcription factors. In this article we tested the hypothesis that human keratinocytes can adopt neural fates after culturing them in suspension with a neural medium. Initially, keratinocytes expressed Keratins and Vimentin. After neural induction, transcriptional upregulation of NESTIN, SOX2, VIMENTIN, SOX1, and MUSASHI1 was observed, concomitant with significant increases in NESTIN detected by immunostaining. However, in vitro differentiation did not yield the expression of neuronal or astrocytic markers. We tested the differentiation potential of control and neural-induced keratinocytes by grafting them in the developing CNS of rats, through ultrasound-guided injection. For this purpose, keratinocytes were transduced with lentivirus that contained the coding sequence of green fluorescent protein. Cell sorting was employed to select cells with high fluorescence. Unexpectedly, 4 days after grafting these cells in the ventricles, both control and neural-induced cells expressed green fluorescent protein together with the neuronal proteins βIII-Tubulin and Microtubule-Associated Protein 2. These results support the notion that in vivo environment provides appropriate signals to evaluate the neuronal differentiation potential of keratinocytes or other non-neural cell populations.

In vitro and in vivo evaluation of a green fluorescent protein-HSV1-TK dual-function pet reporter gene

2001 ◽  
Vol 44 (S1) ◽  
pp. S339-S341
Author(s):  
K. E. Luker ◽  
G. D. Luker ◽  
C. M. Pica ◽  
J. L. Dahlheimer ◽  
T. J. Fahrner ◽  
...  
Keyword(s):  
Green Fluorescent Protein ◽  
Reporter Gene ◽  
Fluorescent Protein ◽  
Dual Function ◽  
In Vivo Evaluation ◽  
Green Fluorescent

432 INHERITANCE OF LENTIVIRAL PHOSPHOGLYCERATE KINASE-ENHANCED GREEN FLUORESCENT PROTEIN (PGK-eGFP) INTEGRANTS OF TRANSGENIC CATTLE

2010 ◽  
Vol 22 (1) ◽  
pp. 373
Author(s):  
M. Reichenbach ◽  
F. A. Habermann ◽  
H. D. Reichenbach ◽  
T. Guengoer ◽  
F. Weber ◽  
...  
Keyword(s):  
Green Fluorescent Protein ◽  
Enhanced Green Fluorescent Protein ◽  
Fluorescent Protein ◽  
Germ Line ◽  
Phosphoglycerate Kinase ◽  
Healthy Male ◽  
Transgenic Founder ◽  
Green Fluorescent

An alternative approach to classic techniques for the generation of transgenic livestock is the use of viral vectors. Using lentiviral vectors (LV) we previously generated transgenic founder cattle with integrants carrying phosphoglycerate kinase (PGK) promoter-enhanced green fluorescent protein (eGFP) expression cassettes (Hofmann et al. 2004 Biol. Reprod. 71, 405-409). The aim of this work was to investigate the transmission of LV-PGK-eGFP integrants through the female and male germ line of transgenic founder cattle in resulting embryos, fetuses, and offspring. The female founder animal was superovulated and artificially inseminated with a nontransgenic bull. Six of the 16 embryos obtained were transferred to synchronized recipient heifers, resulting in 2 pregnancies and birth of 1 healthy male transgenic calf, expressing eGFP as detected by in vivo imaging and real-time PCR. Cryopreserved semen of the founder bull and matured COC of nontransgenic cows were used for in vitro embryo production as previously described by Hiendleder et al. (2004 Biol. Reprod. 71, 217-223). The rates of cleavage and development to blastocysts in vitro corresponded to 52.3 ± 3.8% and 23.5 ± 4.6%, respectively. In vivo expression of eGFP was observed at blastocyst stage (Day 7 after IVF) and was seen in 93.8% (198/211) of all blastocysts. Twenty-four eGFP-positive embryos were transferred to 9 synchronized recipients. Analysis of 2 embryos flushed on Day 15, 2 fetuses recovered on Day 45, and a healthy male transgenic calf revealed consistent high-level expression of eGFP in all tissues investigated. These observations show for the first time transmission of lentiviral integrants through the germ line of female and male transgenic founder cattle. Although eGFP transgenic cattle have been produced before by nuclear transfer from transfected cells, lentiviral transgenesis has the advantage that only one copy of the provirus is integrated at a particular chromosomal integration site. High-fidelity expression of eGFP in embryos, fetuses, and offspring of founders provides an interesting tool for developmental studies in cattle, including interactions of gametes, embryos, and fetuses with their maternal environment.

Cryptococcus neoformans Differential Gene Expression Detected In Vitro and In Vivo with Green Fluorescent Protein

1999 ◽  
Vol 67 (4) ◽  
pp. 1812-1820
Author(s):  
Maurizio del Poeta ◽  
Dena L. Toffaletti ◽  
Thomas H. Rude ◽  
Sara D. Sparks ◽  
Joseph Heitman ◽  
...  
Keyword(s):  
Gene Expression ◽  
Green Fluorescent Protein ◽  
Cryptococcus Neoformans ◽  
Differential Gene Expression ◽  
Fluorescent Protein ◽  
Differential Gene ◽  
Green Fluorescent

Supercharged green fluorescent protein delivers HPV16E7 DNA and protein into mammalian cells in vitro and in vivo

2018 ◽  
Vol 194 ◽  
pp. 29-39 ◽  
Author(s):  
Fatemeh Motevalli ◽  
Azam Bolhassani ◽  
Shilan Hesami ◽  
Sepideh Shahbazi
Keyword(s):  
Green Fluorescent Protein ◽  
Mammalian Cells ◽  
Fluorescent Protein ◽  
Green Fluorescent

In Vitro and In Vivo Characterization of Recombinant Ebola Viruses Expressing Enhanced Green Fluorescent Protein

2007 ◽  
Vol 196 (s2) ◽  
pp. S313-S322 ◽  
Author(s):  
Hideki Ebihara ◽  
Steven Theriault ◽  
Gabriele Neumann ◽  
Judie B. Alimonti ◽  
Joan B. Geisbert ◽  
...  
Keyword(s):  
Green Fluorescent Protein ◽  
Enhanced Green Fluorescent Protein ◽  
Fluorescent Protein ◽  
Green Fluorescent ◽  
In Vivo Characterization

scholarly journals C-terminal tripeptide Ser-Asn-Leu (SNL) of human D-aspartate oxidase is a functional peroxisome-targeting signal

1998 ◽  
Vol 336 (2) ◽  
pp. 367-371 ◽  
Author(s):  
Leen AMERY ◽  
Chantal BREES ◽  
Myriam BAES ◽  
Chiaki SETOYAMA ◽  
Retsu MIURA ◽  
...  
Keyword(s):  
Green Fluorescent Protein ◽  
Amino Acid ◽  
Fluorescent Protein ◽  
Consensus Sequence ◽  
C Terminus ◽  
Targeting Signal ◽  
Fluorescent Pattern ◽  
Green Fluorescent ◽  
Positively Charged

The functionality of the C-terminus (Ser-Asn-Leu; SNL) of human d-aspartate oxidase, an enzyme proposed to have a role in the inactivation of synaptically released d-aspartate, as a peroxisome-targeting signal (PTS1) was investigated in vivoand in vitro. Bacterially expressed human d-aspartate oxidase was shown to interact with the human PTS1-binding protein, peroxin protein 5 (PEX5p). Binding was gradually abolished by carboxypeptidase treatment of the oxidase and competitively inhibited by a Ser-Lys-Leu (SKL)-containing peptide. After transfection of mouse fibroblasts with a plasmid encoding green fluorescent protein (GFP) extended by PKSNL (the C-terminal pentapeptide of the oxidase), a punctate fluorescent pattern was evident. The modified GFP co-localized with peroxisomal thiolase as shown by indirect immunofluorescence. On transfection in fibroblasts lacking PEX5p receptor, GFP–PKSNL staining was cytosolic. Peroxisomal import of GFP extended by PGSNL (replacement of the positively charged fourth-last amino acid by glycine) seemed to be slower than that of GFP–PKSNL, whereas extension by PKSNG abolished the import of the modified GFP. Taken together, these results indicate that SNL, a tripeptide not fitting the PTS1 consensus currently defined in mammalian systems, acts as a functional PTS1 in mammalian systems, and that the consensus sequence, based on this work and that of other groups, has to be broadened to (S/A/C/K/N)-(K/R/H/Q/N/S)-L.

scholarly journals Illuminating the Formation of Lumens

2007 ◽  
Vol 15 (3) ◽  
pp. 3-5
Author(s):  
Stephen W. Carmichael
Keyword(s):  
Animal Model ◽  
Green Fluorescent Protein ◽  
Fluorescent Protein ◽  
Solid Core ◽  
Red Fluorescent Protein ◽  
Neuronal Process ◽  
Two Photon ◽  
Green Fluorescent

How do lumens form? Two mechanisms that come readily to mind are a wrapping model, similar to the wrapping of the myelin sheath around a neuronal process, and a solid core of cells followed by apoptosis of the central cells. Another obvious mechanism that was suggested over 100 years ago is the fusion of intracellular vacuoles. Whereas several recent studies have supported this latter mechanism, it has not yet been proven. Now, the appropriate animal model (zebrafish), the modern techniques (transgenic chimeras), dyes (green fluorescent protein and monomeric red fluorescent protein) that can be linked to proteins to label vacuoles, and two-photon imaging in real time finally have provided the strongest support yet. In an article by Makoto Kamei, Brian Saunders, Kayla Bayless, Louis Dye, George Davis, and Brant Weinstein the assembly of endothelial tubes from intracellular vacuoles was observed in vitro and in vivo.

Sign in / Sign up

Export Citation Format

Share Document