Выявление мутации Ser450Leu в гене rpoB Mycobacterium tuberculosis методом аллель-специфичной изотермической петлевой амплификации ДНК

Для выявления генетических мутаций широко используют достаточно трудоемкий и дорогостоящий метод полимеразной цепной реакции (ПЦР). Целью работы было оценить возможность применения двух схем метода аллель-специфичной изотермической петлевой амплификации (loop-mediated isothermal amplification, LAMP) для выявления мутации TCG/TTG (S450L) в гене rpoB Mycobacterium tuberculosis. Использовали 48 клинических изолятов M. tuberculosis и 11 образцов мокроты, выбранных случайным образом и полученных в микробиологической лаборатории г. Новосибирска от пациентов с впервые выявленным заболеванием. Показано, что применение схемы анализа с использованием аллель-специфичного праймера FIP по сравнению с F3 имеет лучшую разрешающую способность: разница между временем амплификации мутации и аллеля дикого типа составила 22 ± 2,4 против 13 ± 4,1 мин (p = 0,0011). При использовании 100 геном-эквивалентов ДНК истинно положительный сигнал (амплификация гена rpoB с мутацией при использовании соответствующего аллель-специфического праймера) детектировался после 29,4 ± 3,4 мин. Положительный сигнал визуализировался после добавления в реакцию SYBR Green I, как при освещении дневным светом, так и при использовании трансиллюминатора с УФ-излучением. С помощью разработанного нами метода была проанализирована выборка ДНК 20 RIFR изолятов M. tuberculosis, несущих мутацию Ser450Leu в гене rpoB, 10 RIFR изолятов, несущих другие мутации в гене rpoB, а также 18 RIFs изолятов без мутаций; наличие мутаций в образцах было определено с помощью классического секвенирования по Сенгеру. Чувствительность и специфичность LAMP для выявления мутации Ser450Leu в гене rpoB составили 100%. Данный подход позволяет использовать в качестве ДНК грубые лизаты микобактерий, что сокращает тотальное время анализа до 1,5 ч.