Quantitative expression analysis of blastocyst-derived gene transcripts in preimplantation developmental stages of in vitro-produced bovine embryos using real-time polymerase chain reaction technology

2004 ◽  
Vol 16 (8) ◽  
pp. 753 ◽  
Author(s):  
Nermin El-Halawany ◽  
Siriluck Ponsuksili ◽  
Klaus Wimmers ◽  
Markus Gilles ◽  
Dawit Tesfaye ◽  
...  
Keyword(s):  
Polymerase Chain Reaction ◽  
Real Time ◽  
Expression Pattern ◽  
Embryo Development ◽  
Developmental Stages ◽  
Bovine Embryo ◽  
Chain Reaction ◽  
Quantitative Expression ◽  
Polymerase Chain

The main objective of the present study was to analyse the quantitative expression pattern of genes from a subtracted blastocyst transcriptome throughout the preimplantation developmental stages of in vitro-produced bovine oocytes and embryos. For this purpose, Day 5 morula (M) cDNAs were subtracted from Day 7 blastocyst (B) cDNAs (B–M) and used to establish a B–M subtracted cDNA library, as reported previously. From the total generated clones, 19 were analysed quantitatively. The mRNA samples isolated from pools of immature oocytes (n = 150), mature oocytes (n = 150) and two-cell (n = 80), four-cell (n = 40), eight-cell (n = 20), morula (n = 6) and blastocyst (n = 3) embryos were reverse transcribed and subjected to real-time polymerase chain reaction (PCR) using sequence-specific primers and SYBR green as the DNA dye. A relative standard curve method was used to analyse the real-time data taking the morula stage as a calibrator. Applying suppression subtractive hybridisation (SSH), a total of 71 clones, which represent 33 different expressed sequence tags, were generated and available for analysis. Most transcripts were analysed for the first time in bovine embryogenesis. The real-time PCR has validated the results of SSH positively for 84% (16/19) of transcripts, whereas 16% (3/19) showed deviation in the expression pattern from the one seen during SSH. Several transcript-specific expression patterns were observed for genes that play decisive roles in bovine embryogenesis. In addition to identification, accurately quantifying the expression profiles of transcripts during development will pave the way towards understanding the molecular mechanisms of embryogenesis and their potential role in early embryo development. Most importantly, the present study has contributed to the enrichment of bovine embryo gene collection by generating new transcripts involved in bovine embryo development.

Quantitative expression analysis of Bodhesin genes in the buck (Capra hircus) reproductive tract by real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR)

2009 ◽  
Vol 110 (3-4) ◽  
pp. 245-255 ◽  
Author(s):  
Luciana M. Melo ◽  
Antônia S.F. Nascimento ◽  
Felipe G. Silveira ◽  
Rodrigo M.S. Cunha ◽  
Nathália A.C. Tavares ◽  
...  
Keyword(s):  
Polymerase Chain Reaction ◽  
Real Time ◽  
Expression Analysis ◽  
Reproductive Tract ◽  
Capra Hircus ◽  
Chain Reaction ◽  
Quantitative Expression ◽  
Qrt Pcr ◽  
Polymerase Chain

scholarly journals In vitro characterization and analysis of probiotic species in the chicken intestine by real-time polymerase chain reaction

2019 ◽  
Vol 98 (11) ◽  
pp. 5840-5846 ◽  
Author(s):  
Revathi Shanmugasundaram ◽  
Mohamad Mortada ◽  
G Raj Murugesan ◽  
Ramesh K Selvaraj
Keyword(s):  
Polymerase Chain Reaction ◽  
Real Time ◽  
Chain Reaction ◽  
Chicken Intestine ◽  
In Vitro Characterization ◽  
Polymerase Chain

Sex determination of buffalo embryos (Bubalus bubalis) by polymerase chain reaction

Zygote ◽  
2003 ◽  
Vol 11 (1) ◽  
pp. 17-22 ◽  
Author(s):  
Laura Manna ◽  
Gianluca Neglia ◽  
Marcella Marino ◽  
Bianca Gasparrini ◽  
Rossella Di Palo ◽  
...  
Keyword(s):  
Polymerase Chain Reaction ◽  
Sex Determination ◽  
Y Chromosome ◽  
Developmental Stages ◽  
Standard Procedure ◽  
Isoamyl Alcohol ◽  
Chain Reaction ◽  
Polymerase Chain

The aim of this study was to identify a simple, rapid method for sex determination of in vitro produced buffalo embryos, amplifying Y-chromosome-specific repeat sequences by polymerase chain reaction (PCR). Buffalo oocytes collected from slaughtered animals were matured, fertilised and cultured in vitro for 7 days. On day 7 embryos were evaluated and divided in to six groups according to developmental stage (2, 4, 8, 16 cells, morulae and blastocyst). Each embryo was stored singly in phosphate-buffered saline at −20 °C until PCR. Two different methods of extraction of DNA were compared: a standard procedure (ST), using a normal extraction by phenol-chloroform, isoamyl alcohol and final precipitation in absolute ethanol and a direct procedure (DT), using a commercial kit (Qiaquik-Qiagen mini blood). A pair of bovine satellite primers and two pairs of different bovine Y-chromosome-specific primers (BRY4.a and BRY.1) were used in the PCR assay on embryos and on whole blood samples collected from male and female adult buffaloes, used as control. The trial was carried out on 359 embryos (193 for ST and 166 for DT). When DNA samples from blood were amplified, the sex determined by PCR always corresponded to the anatomical sex. Embryo sexing was not possible in two embryos in ST and one embryo in DT. Both extraction protocols recovered sufficient quantities of target DNA at all developmental stages, but the time required for the ST (24 h) limits its use in embryo sexing and supports the use of commercial extraction kits (5 h).

scholarly journals Διερεύνηση του ρόλου των αδρενεργικών και ντοπαμινεργικών συστημάτων στη ρύθμιση των κυτοχρωμάτων CYP3A1/2, CYP2C11 και CYP2D1/2

2012 ◽  
Author(s):  
Ευάγγελος-Παναγιώτης Δασκαλόπουλος
Keyword(s):  
Polymerase Chain Reaction ◽  
Real Time ◽  
Rt Pcr ◽  
Chain Reaction ◽  
Polymerase Chain

Τα ηπατικά κυτοχρώματα CYPs (P450s) είναι μια μεγάλη υπερ-οικογένεια πρωτεϊνών, οι οποίες εντοπίζονται σε όλους τους ζωντανούς οργανισμούς. Η σημασία τους είναι τεράστια, αφού μεταβολίζουν μια τεράστια ποικιλία ενδογενών ουσιών αλλά και ξενοβιοτικών. Οι πιο σημαντικές υποοικογένειες κυτοχρωμάτων CYP είναι η CYP3A, η CYP2C και η CYP2D, εξαιτίας του ρόλου τους στο μεταβολισμό της πλειονότητας των πιο συχνά συνταγογραφούμενων φαρμάκων. Η γνώση όσον αφορά τους παράγοντες, που μπορούν να προκαλέσουν επαγωγή ή αναστολή των κυτοχρωμάτων CYP είναι εξαιρετικής σημασίας, αφού κάθε μεταβολή στην έκφραση και την δραστικότητά τους μπορεί να έχει σοβαρότατες συνέπειες στην αποτελεσματικότητα της φαρμακευτικής αγωγής αλλά και στην φαρμακοτοξικότητα. Η αναστολή των ηπατικών CYPs μπορεί να οδηγήσει σε αυξημένα επίπεδα ενός φαρμάκου-υποστρώματος στο πλάσμα και στην ανάπτυξη τοξικών εκδηλώσεων. Αντίθετα, η επαγωγή των CYPs μπορεί να οδηγήσει σε μειωμένη αποτελεσματικότητα ή ακόμη και πλήρη αποτυχία της φαρμακοθεραπείας. Σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν η διερεύνηση στον επίμυ της επίδρασης του στρες στη ρύθμιση της έκφρασης των πιο σημαντικών για τον μεταβολισμό φαρμάκων κυτοχρωμάτων, των CYP3A, CYP2C και CYP2D. Επίσης, διερευνήθηκε ο ρόλος των αδρενεργικών υποδοχέων, των γλυκοκορτικοειδών καθώς και των μονοπατιών μεταγωγής σήματος (cAMP/PKA, JNK, GH/STAT5b) στη ρύθμιση των ανωτέρω κυτοχρωμάτων. Μελετήθηκε επίσης, ο ρόλος των D2-ντοπαμινεργικών υποδοχέων στη ρύθμιση της έκφρασης των CYP γονιδίων καθώς και η συμμετοχή του μονοπατιού μεταγωγής σήματος PI3K/Akt/FoxO1, αλλά και του μεταγραφικού παράγοντα STAT5b. Για την ερευνητική προσέγγιση αυτών των θεμάτων, έγιναν τόσο in vivo πειράματα με ενήλικες αρσενικούς επίμυες, όσο και in vitro πειράματα με καλλιέργειες πρωτογενών ηπατοκυττάρων, που απομονώθηκαν από το ήπαρ επιμύων. Οι μέθοδοι, οι οποίες χρησιμοποιήθηκαν συμπεριλαμβάνουν την Υγρή Χρωματογραφία Υψηλής Απόδοσης (HPLC) για την μέτρηση την ενζυμικής δραστικότητας των υπό μελέτην CYP3A, CYP2C και CYP2D, την ανοσοαποτύπωση κατά Western για την εκτίμηση των μεταβολών σε επίπεδο αποπρωτεΐνης, καθώς και την μέθοδο real-time polymerase chain reaction (RT-PCR, q-PCR) για την ποσοτική εκτίμηση των επιπέδων mRNA των ανωτέρω CYP γονιδίων. Τα αποτελέσματα αυτής της μελέτης κατέδειξαν ότι το ψυχολογικό στρες είναι ένας παράγοντας τεράστιας σημασίας για τη ρύθμιση της έκφρασης των CYPs. Πιο συγκεκριμένα, το στρες της μητρικής αποστέρησης, στο οποίο εκτέθηκαν οι επίμυες σε πολύ μικρή ηλικία προκάλεσε την αύξηση της έκφρασης των CYP3A1/2 και CYP2C11, ενώ το CYP2D δεν επηρεάστηκε σημαντικά. Αντιθέτως, το στρες περιορισμού προκάλεσε σημαντικές μεταβολές στην έκφραση του CYP3A2, του CYP2D και μικρότερες μεταβολές στο CYP2A. Επιπροσθέτως, επιβεβαιώθηκε η επαγωγική δράση των γλυκοκορτικοειδών στο CYP3A και η κατασταλτική τους δράση στο CYP2C. Σημαντικά ευρήματα μετά από in vivo και in vitro πειράματα, τα οποία επικεντρώθηκαν στη μελέτη των αδρενεργικών μονοπατιών φανέρωσαν ότι τα μονοπάτια cAMP/PKA, JNK και του άξονα GH/STAT5b διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στον έλεγχο της ρύθμισης της έκφρασης των CYPs. Η συμμετοχή των πυρηνικών υποδοχέων PXR, RXR και HNF4α φαίνεται να είναι σημαντική στις μεταβολές που παρατηρήθηκαν στην έκφραση αυτών των CYPs. Eπιπλέον, η αναστολή των D2-ντοπαμινεργικών υποδοχέων in vivo, οδήγησε σε μεγάλη καταστολή των CYP3A, CYP2C και CYP2D. Αντιθέτως, αναστολή των ηπατικών D2-υποδοχέων in vitro, οδήγησε σε επαγωγή αυτών των CYPs. Αυτό το εύρημα οδήγησε στην υπόθεση ότι η ινσουλίνη πιθανόν διαδραματίζει στρατηγικής σημασίας ρόλο στον έλεγχο της ρύθμισης της έκφρασης των CYPs, αφού αποδείχθηκε ότι η αναστολή in vivο των D2-υποδοχέων ενεργοποιεί το ινσουλινοεξαρτώμενο μονοπάτι PI3K/Akt, ενώ περαιτέρω έρευνες έδειξαν τον FoxO1 ως τελικό μεταγραφικό παράγοντα ρύθμισης. Παράλληλα, ο άξονας GH/STAT5b φαίνεται να παίζει επίσης πολύ σημαντικό ρυθμιστικό ρόλο και στην περίπτωση των D2-ντοπαμινεργικών μονοπατιών. Συμπερασματικά, η μελέτη αυτή έδειξε ότι το στρες, τα γλυκοκορτικοειδή και αγωνιστές αδρενεργικών υποδοχέων αποτελούν παράγοντες, που πρέπει πάντα να λαμβάνονται υπόψιν πριν τη συνταγογράφηση σε ασθενείς. Επιπλέον, η μελέτη αυτή κατέδειξε για πρώτη φορά την επίδραση των παγκρεατικών D2-ντοπαμινεργικών υποδοχέων και του μονοπατιού PI3K/Akt/FoxO1 στη ρύθμιση της έκφρασης των CYP3A, CYP2C και CYP2D. Διαπιστώθηκε επίσης, η συμμετοχή της GH, της PRL και των θυρεοειδικών ορμονών στις μεταβολές που προκάλεσαν οι φαρμακολογικοί χειρισμοί των D2-ντοπαμινεργικών υποδοχέων.

Evaluation of Real-Time Polymerase Chain Reaction for the Detection of Methicillin-ResistantStaphylococcus aureuson Environmental Surfaces

2007 ◽  
Vol 28 (8) ◽  
pp. 1003-1005 ◽  
Author(s):  
Jonathan A. Otter ◽  
Nancy L. Havill ◽  
John M. Boyce
Keyword(s):  
Staphylococcus Aureus ◽  
Polymerase Chain Reaction ◽  
In Vitro Culture ◽  
Real Time ◽  
Rt Pcr ◽  
Chain Reaction ◽  
Methicillin Resistant ◽  
Environmental Surfaces ◽  
Polymerase Chain

We compared real-time polymerase chain reaction (RT-PCR) with in vitro culture for detecting methicillin-resistantStaphylococcus aureusin samples from environmental surfaces. The sensitivity of RT-PCR, compared with culture, was 92.5%, and the specificity was 51.4%. Because of poor specificity, the RT-PCR kit tested is not suitable for the detection of MRSA on hospital surfaces.

Nerve growth factor promotes expression of novel genes in intervertebral disc cells that regulate tissue degradation

2014 ◽  
Vol 21 (4) ◽  
pp. 653-661 ◽  
Author(s):  
Ting-Hsien Kao ◽  
Yi-Jen Peng ◽  
Hsi-Kai Tsou ◽  
Donald M. Salter ◽  
Herng-Sheng Lee
Keyword(s):  
Gene Expression ◽  
Polymerase Chain Reaction ◽  
Nerve Growth Factor ◽  
Growth Factor ◽  
Real Time ◽  
Chain Reaction ◽  
Nerve Growth ◽  
Polymerase Chain ◽  
Ivd Degeneration

Object Increased neurotrophin activity in degenerative intervertebral discs (IVDs) is one potential cause of chronic low-back pain (LBP). The aim of the study was to assess if nerve growth factor (NGF) might alter gene expression of IVD cells and contribute to disc degeneration by enhancing expression or activity of factors that cause breakdown of IVD matrix. Methods Rat-tail IVD cells were stimulated by NGF and subjected to microarray analysis. Real-time polymerase chain reaction, Western blotting, and immunocytochemistry of rat and human IVD cells and tissues treated with NGF in vitro in the absence or presence of the NGF inhibitor Ro 08-2750 were used to confirm findings of the microarray studies. Phosphorylation of mitogen-activated protein kinase (MAPK) was used to identify cell signaling pathways involved in NGF stimulation in the absence or presence of Ro 08-2750. Results Microarray analysis demonstrated increased expression of chitinase 3-like 1 (Chi3l1), lipocalin 2 (Lcn2), and matrix metalloproteinase–3 (Mmp3) following NGF stimulation of rat IVD cells in vitro. Increased gene expression was confirmed by real-time polymerase chain reaction with a relative increase in the Mmp/Timp ratio. Increased expression of Chi3l1, Lcn2, and Mmp3 following NGF stimulation was also demonstrated in rat cells and human tissue in vitro. Effects of NGF on protein expression were blocked by an NGF inhibitor and appear to function through the extracellular-regulation kinase 1/2 (ERK1/2) MAPK pathway. Conclusions Nerve growth factor has potential effects on matrix turnover activity and influences the catabolic/anabolic balance of IVD cells in an adverse way that may potentiate IVD degeneration. Anti-NGF treatment might be beneficial to ameliorate progressive tissue breakdown in IVD degeneration and may lead to pain relief.

Sign in / Sign up

Export Citation Format

Share Document