scholarly journals Invading the Yeast Nucleus: a Nuclear Localization Signal at the C Terminus of Ty1 Integrase Is Required for Transposition In Vivo

1998 ◽  
Vol 18 (2) ◽  
pp. 1115-1124 ◽  
Author(s):  
Margaret A. Kenna ◽  
Carrie Baker Brachmann ◽  
Scott E. Devine ◽  
Jef D. Boeke
Keyword(s):  
Nuclear Localization ◽  
Nuclear Localization Signal ◽  
Reverse Transcriptase Activity ◽  
Deletion Mutants ◽  
Amino Acid Residues ◽  
Wild Type ◽  
C Terminus ◽  
Localization Signal

ABSTRACT Retrotransposon Ty1 faces a formidable cell barrier during transposition—the yeast nuclear membrane which remains intact throughout the cell cycle. We investigated the mechanism by which transposition intermediates are transported from the cytoplasm (the presumed site of Ty1 DNA synthesis) to the nucleus, where they are integrated into the genome. Ty1 integrase has a nuclear localization signal (NLS) at its C terminus. Both full-length integrase and a C-terminal fragment localize to the nucleus. C-terminal deletion mutants in Ty1 integrase were used to map the putative NLS to the last 74 amino acid residues of integrase. Mutations in basic segments within this region decreased retrotransposition at least 50-fold in vivo. Furthermore, these mutant integrase proteins failed to localize to the nucleus. Production of virus-like particles, reverse transcriptase activity, and complete in vitro Ty1 integration resembled wild-type levels, consistent with failure of the mutant integrases to enter the nucleus.

Molecular analysis of HURP protein’s role in oncogenesis

2014 ◽  
Author(s):  
Ιλόνα Κεσίσοβα
Keyword(s):  
Nuclear Localization ◽  
Nuclear Localization Signal ◽  
Self Organization ◽  
Aurora A ◽  
Quantitative Real Time Pcr ◽  
Microtubule Associated Proteins ◽  
Associated Proteins ◽  
Localization Signal

Η µιτωτική άτρακτος είναι µία µοριακή µηχανή δοµικά βασισµένη σε µικροσωληνίσκους, που παρουσιάζει ιδιαίτερη δυναµικότητα και διενεργεί την ίση κατανοµή των διπλασιασµένων χρωµοσωµάτων στα δύο θυγατρικά κύτταρα κατά την κυτταρική διαίρεση.Ο σχηµατισµός της ατράκτου σε σωµατικά κύτταρα θηλαστικών βασίζεται στις συντονισµένες δραστηριότητες δύο βιοχηµικών µονοπατιών: το µονοπάτι εξαρτώµενο από τα κεντροσώµατα και το µονοπάτι εξαρτώµενο από τη χρωµατίνη, τα οποία ικανοποιούν δύο ευρέως αποδεκτά µοντέλα για τη συναρµολόγηση της ατράκτου, το µοντέλο “search–and-capture” και το µοντέλο του “self-organization”,αντίστοιχα. Γνωρίζουµε ότι η χρωµατίνη παράγει ενδοκυτταρικά σήµατα χωρικής οργάνωσης που ευνοούν την εµπυρήνωση ή/και τη σταθεροποίηση των µικροσωληνίσκων. H κύρια ενδοκυττάρια διαβάθµιση συγκέντρωσης που δηµιουργείται από τα χρωµοσώµατα και συµβάλλει στην αυτο-οργάνωση της µιτωτικής ατράκτου είναι η διαβάθµιση συγκέντρωσης του RanGTP. Η µικρή GTPάσηRan όταν είναι συνδεδεµένη µε GTP, παρουσιάζει µια ενδογενή φθίνουσα διαβάθµιση συγκέντρωσης γύρω από την επιφάνεια των χρωµοσωµάτων λόγω παρουσίας εκεί του παράγοντα ανταλλαγής GTP,RCC1. Το RanGTP που επάγεται από τη χρωµατίνη προωθεί τη συναρµολόγηση της ατράκτου µέσω απελευθέρωσης παραγόντων που ευνοούν την συναρµολόγηση της ατράκτου (Spindle AssemblyFactors, SAFs) και περιέχουν σήµα πυρηνικού εντοπισµού (Nuclear Localization Signal, NLS) από ανασταλτικά σύµπλοκα µε ιµπορτίνες α ή / και β. Το ρυθµιστικό δίκτυο της συναρµολόγησης της ατράκτου ελέγχεται επιπροσθέτως από τη δράση των µιτωτικών κινασών που οδηγούν σε γεγονότα αναστρέψιµης φωσφορυλίωσης, ρυθµίζοντας έτσι τη λειτουργία των πρωτεϊνών που προσδένονται σε µικροσωληνίσκους (Microtubule Associated Proteins, MAPs) και των κινεσινών.Η σωστή διαµόρφωση και λειτουργία της µιτωτικής ατράκτου απαιτούνται για τη διενέργεια της κυτταρική διαίρεση χωρίς σφάλµατα. Παρ 'όλα αυτά, ακόµη και µια µικρή απορρύθµιση αυτών των µιτωτικών πρωτεϊνών, που δεν θέτει σε κίνδυνο τη βιωσιµότητα των κυττάρων, µπορεί να οδηγήσει σε ανώµαλη κυτταρική διαίρεση και τελικά σε ανευπλοειδία, ένα χαρακτηριστικό γνώρισµα του καρκίνου.Κατά τα τελευταία χρόνια, έχουν αναφερθεί γενετικές και επιγενετικές αλλοιώσεις σε έναν σηµαντικόαριθµό µιτωτικών γονιδίων σε ανθρώπινους όγκους. Οι αλλοιώσεις αυτές που παρουσιάζονται σε µιτωτικά γονίδια και σχετίζονται µε τον καρκίνο φαίνεται να επηρεάζουν κυρίως τα επίπεδα γονιδιακής έκφρασης. Η πλειοψηφία των µιτωτικών γονιδίων που παρουσιάζουν αλλοιώσεις στον καρκίνο περιλαµβάνει κυρίως κινάσες, πρωτεΐνες του σηµείου ελέγχου της ατράκτου και δοµικές πρωτεΐνες της ατράκτου συµπεριλαµβανοµένων των πρωτεϊνών που προσδένονται σε µικροσωληνίσκους και των κινεσινών.Για το σκοπό αυτό κατευθυνθήκαµε προς την µελέτη µίας πρωτεΐνης που προσδένεται σε µικροσωληνίσκους µε ρόλο-κλειδί στον σχηµατισµό ατράκτου, την πρωτεΐνη HURP (Hepatoma UpRegulated Protein) καθώς και προς τη µελέτη του πιθανού της ρόλου στον καρκίνο. Η HURP έχειαρχικά αναγνωριστεί ως µέρος ενός RanGTP εξαρτώµενoυ πολυ-πρωτεϊνικού σύµπλοκου που προάγει την συγκρότηση της διπολικής ατράκτου σε εκχυλίσµατα αυγών του βατράχου Xenopus και αποτελείται από δύο επιπλέον πρωτεΐνες που προσδένονται σε µικροσωληνίσκους την TPX2 και τηνXMAP215, την κινεσίνη Eg5 και την κινάση Aurora Α. Η HURP ρυθµίζεται αυστηρά κατά τη διάρκειατης µίτωσης ως προς τα επίπεδα έκφρασής της και ως προς τον εντοπισµό της. Τα επίπεδα της πρωτεΐνης HURP φτάνουν στο µέγιστο κατά τη φάση G2/M του κυτταρικού κύκλου ενώ ο εντοπισµός της πρωτεΐνης περιορίζεται σε ένα υποσύνολο των µικροσωληνίσκων της ατράκτου, τους µικροσωληνίσκους του κινητοχώρου (k-ΜΤs). Στη µεταφασική άτρακτο η HURP εντοπίζεται κυρίως στους µικροσωληνίσκους του κινητοχώρου σε διαβάθµιση συγκέντρωσης κατά µήκος του άξονα των δύο πόλων παρουσιάζοντας υψηλότερη συγκέντρωση σε περιοχές κοντά στην χρωµατίνη, φθίνονταςπρος τους πόλους. Η HURP αποτελεί υπόστρωµα της Aurora Α και η φωσφορυλίωσή της διεγείρει τον ογκογόνο µετασχηµατισµό καλλιεργηµένων κυττάρων.Για να κατανοήσουµε καλύτερα το ρόλο της HURP στη συναρµολόγηση της ατράκτου αναπτύξαµε µικρά-µόρια αναστολείς της κινάσης Aurora Α. Σε αυτή τη µελέτη, από ένα σύνολο 105 πιθανών µικροµοριακών αναστολέων, δύο ενώσεις ο Tripolin Α και ο Tripolin Β, βρέθηκαν να αναστέλλουν την δραστικότητα της Aurora A κινάσης in vitro. Ωστόσο, σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα, µόνο ο TripolinΑ δρα ως αναστολέας της Aurora Α. Συνδυάσαµε βιοχηµικά πειράµατα in vitro και µελέτες συνεστιακής µικροσκοπίας µεµονοµένων κυττάρων in vivo, για να εξετάσουµε τη βιολογική δραστικότητα τουTripolin Α. Τα ευρήµατά µας αποδεικνύουν ότι ο Tripolin Α είναι ένας αναστολέας της Aurora Α, µη-ανταγωνιστικός του ΑΤΡ. Ο Tripolin Α µειώνει τον εντοπισµό της Aurora Α στους µικροσωληνίσκουςτης ατράκτου, επηρεάζει την ακεραιότητα των κεντροσωµάτων, επηρεάζει τον σχηµατισµό και το µήκος της ατράκτου, καθώς και τη δυναµική των µικροσωληνίσκων στην µεσόφαση, αποτελέσµατα που συνάδουν µε απαλοιφή της Aurora A. Ενδιαφέρον παρουσιάζει ότι ο Tripolin Α επηρεάζει την διαβάθµιση συγκέντρωσης της HURP προς τα χρωµοσώµατα, αλλά όχι την πρόσδεσή της στους µικροσωληνίκους. Πειράµατα ανάκτησης φθορισµού µετά από αποχρωµατισµό FRAP (FluorescenceRecovery After Photobleaching, FRAP) δείχνουν ότι η Aurora A ρυθµίζει την ανταλλαγή της HURP στις θέσεις πρόσδεσής της στους µικροσωληνίκους της ατράκτου. Ως εκ τούτου, καταλήγουµε στο συµπέρασµα ότι η φωσφορυλίωση από την Aurora A διατηρεί την διαβάθµιση συγκέντρωσης του εντοπισµού της HURP στην άτρακτο.Προγενέστερες µελέτες γονιδιακής έκφρασης έχουν εντοπίσει υπερέκφραση της HURP σε ανθρώπινους καρκίνους όπως τον καρκίνο του ήπατος και της ουροδόχου κύστης. Για το σκοπό αυτό εξετάσαµε τα επίπεδα γονιδιακής έκφρασης της HURP σε µια οµάδα κυτταρικών σειρών που αντιπροσωπεύουν την πολυσταδιακή χηµική καρκινογένεση της επιδερµίδας του ποντικού,προκειµένου να αναπαραστήσουµε την διαδικασία πολλαπλών βηµάτων για την ανάπτυξη του καρκίνου, σε ένα µοντέλο κυτταρικών σειρών. Οι κυτταρικές σειρές αντιπροσωπεύουν την ανάπτυξη των τριών διαφορετικών στάδιων της καρκινογένεσης, την έναρξης, την προώθηση και την εξέλιξης του όγκου και προέρχονται από όγκους του δέρµατος ποντικού που επάγονται σε δύο στάδια, µε επίδρασηDMBA / ΤΡΑ (πολυκυκλικός αρωµατικός υδρογονάνθρακας / φορβολικός εστέρας). Εφαρµόσαµε λοιπόν, ανάλυση γονιδιακής έκφρασης χρησιµοποιώντας ποσοτική PCR πραγµατικού χρόνου(Quantitative Real Time PCR, qPCR) και αποτύπωµα κατά Western καi βρήκαµε ότι τα επίπεδα mRNAκαι πρωτεΐνης του γονιδίου της Hurp είναι αυξηµένα στις κυτταρικές σειρές που προέρχονται απόκαρκινώµατα πλακώδων κυττάρων και από αναπλαστικά ατρακτοειδή καρκίνωµατα σε σύγκριση µε τις κυτταρικές σειρές που προέρχονται από καλοήθη θηλώµατα. Συλλογικά, προτείνουµε ότι τα επίπεδα έκφρασης της HURP στον καρκίνο δεν συσχετίζονται µε την καλοήθη υπερπλασία αλλά αυξάνουν µε την κακοήθη εξαλλαγή.Στο σύνολό τους τα αποτελέσµατα αυτής της µελέτης αποκάλυψαν µια νέα ρυθµιστική λειτουργία της κινάσης Aurora A στην πρωτεΐνη HURP πάνω στη µιτωτική άτρακτο. Επιπλέον έχουµε δώσει νέες κατευθύνσεις σχετικά µε το ρόλο της HURP στην εξέλιξη του καρκίνου.

scholarly journals Brown Spiders’ Phospholipases-D with Potential Therapeutic Applications: Functional Assessment of Mutant Isoforms

Biomedicines ◽  
2021 ◽  
Vol 9 (3) ◽  
pp. 320
Author(s):  
Thaís Pereira da Silva ◽  
Fernando Jacomini de Castro ◽  
Larissa Vuitika ◽  
Nayanne Louise Costacurta Polli ◽  
Bruno César Antunes ◽  
...  
Keyword(s):  
Structural Changes ◽  
Capillary Permeability ◽  
Structural Data ◽  
Histopathological Analysis ◽  
Amino Acid Residues ◽  
Wild Type ◽  
Antigenic Properties ◽  
Harmful Effects

Phospholipases-D (PLDs) found in Loxosceles spiders’ venoms are responsible for the dermonecrosis triggered by envenomation. PLDs can also induce other local and systemic effects, such as massive inflammatory response, edema, and hemolysis. Recombinant PLDs reproduce all of the deleterious effects induced by Loxosceles whole venoms. Herein, wild type and mutant PLDs of two species involved in accidents—L. gaucho and L. laeta—were recombinantly expressed and characterized. The mutations are related to amino acid residues relevant for catalysis (H12-H47), magnesium ion coordination (E32-D34) and binding to phospholipid substrates (Y228 and Y228-Y229-W230). Circular dichroism and structural data demonstrated that the mutant isoforms did not undergo significant structural changes. Immunoassays showed that mutant PLDs exhibit conserved epitopes and kept their antigenic properties despite the mutations. Both in vitro (sphingomyelinase activity and hemolysis) and in vivo (capillary permeability, dermonecrotic activity, and histopathological analysis) assays showed that the PLDs with mutations H12-H47, E32-D34, and Y228-Y229-W230 displayed only residual activities. Results indicate that these mutant toxins are suitable for use as antigens to obtain neutralizing antisera with enhanced properties since they will be based on the most deleterious toxins in the venom and without causing severe harmful effects to the animals in which these sera are produced.

scholarly journals BCL3 encodes a nuclear protein which can alter the subcellular location of NF-kappa B proteins.

1994 ◽  
Vol 14 (6) ◽  
pp. 3915-3926 ◽  
Author(s):  
Q Zhang ◽  
J A Didonato ◽  
M Karin ◽  
T W McKeithan
Keyword(s):  
Nuclear Localization Signal ◽  
Nuclear Protein ◽  
Subcellular Location ◽  
Lymphocytic Leukemia ◽  
Wild Type ◽  
Nf Kappa B ◽  
Subnuclear Localization ◽  
I Kappa B Alpha ◽  
Localization Signal

BCL3 is a candidate proto-oncogene involved in the recurring translocation t(14;19) found in some patients with chronic lymphocytic leukemia. BCL3 protein acts as an I kappa B in that it can specifically inhibit the DNA binding of NF-kappa B factors. Here, we demonstrate that BCL3 is predominantly a nuclear protein and provide evidence that its N terminus is necessary to direct the protein into the nucleus. In contrast to I kappa B alpha (MAD3), BCL3 does not cause NF-kappa B p50 to be retained in the cytoplasm; instead, in cotransfection assays, it alters the subnuclear localization of p50. The two proteins colocalize, suggesting that they interact in vivo. Further immunofluorescence experiments showed that a mutant p50, lacking a nuclear localization signal and restricted to the cytoplasm, is brought into the nucleus in the presence of BCL3. Correspondingly, a wild-type p50 directs into the nucleus a truncated BCL3, which, when transfected alone, is found in the cytoplasm. We tested whether BCL3 could overcome the cytoplasmic retention of p50 by I kappa B alpha. Results from triple cotransfection experiments with BCL3, I kappa B alpha, and p50 implied that BCL3 can successfully compete with I kappa B alpha and bring p50 into the nucleus; thus, localization of NF-kappa B factors may be affected by differential expression of I kappa B proteins. These novel properties of BCL3 protein further establish BCL3 as a distinctive member of the I kappa B family.

Novel REST Truncation Mutations Causing Hereditary Gingival Fibromatosis

2021 ◽  
pp. 002203452199662
Author(s):  
J.T. Chen ◽  
C.H. Lin ◽  
H.W. Huang ◽  
Y.P. Wang ◽  
P.C. Kao ◽  
...  
Keyword(s):  
Nuclear Localization ◽  
Genetic Disorder ◽  
Dominant Negative ◽  
Dominant Negative Effect ◽  
Wild Type ◽  
Negative Effect ◽  
Localization Signal ◽  
Gingival Fibromatosis

Hereditary gingival fibromatosis (HGF) is a rare genetic disorder featured by nonsyndromic pathological overgrowth of gingiva. The excessive gingival tissues can cause dental, masticatory, and phonetic problems, which impose severe functional and esthetic burdens on affected individuals. Due to its high recurrent rate, patients with HGF have to undergo repeated surgical procedures of gingival resection, from childhood to adulthood, which significantly compromises their quality of life. Unraveling the genetic etiology and molecular pathogenesis of HGF not only gains insight into gingival physiology and homeostasis but also opens avenues for developing potential therapeutic strategies for this disorder. Recently, mutations in REST (OMIM *600571), encoding a transcription repressor, were reported to cause HGF (GINGF5; OMIM #617626) in 3 Turkish families. However, the functions of REST in gingival homeostasis and pathogenesis of REST-associated HGF remain largely unknown. In this study, we characterized 2 HGF families and identified 2 novel REST mutations, c.2449C>T (p.Arg817*) and c.2771_2793dup (p.Glu932Lysfs*3). All 5 mutations reported to date are nonsenses or frameshifts in the last exon of REST and would presumably truncate the protein. In vitro reporter gene assays demonstrated a partial or complete loss of repressor activity for these truncated RESTs. When coexpressed with the full-length protein, the truncated RESTs impaired the repressive ability of wild-type REST, suggesting a dominant negative effect. Immunofluorescent studies showed nuclear localization of overexpressed wild-type and truncated RESTs in vitro, indicating preservation of the nuclear localization signal in shortened proteins. Immunohistochemistry demonstrated a comparable pattern of ubiquitous REST expression in both epithelium and lamina propria of normal and HGF gingival tissues despite a reduced reactivity in HGF gingiva. Results of this study confirm the pathogenicity of REST truncation mutations occurring in the last exon causing HGF and suggest the pathosis is caused by an antimorphic (dominant negative) disease mechanism.

Hairless is translocated to the nucleus via a novel bipartite nuclear localization signal and is associated with the nuclear matrix

2001 ◽  
Vol 114 (2) ◽  
pp. 367-376
Author(s):  
K. Djabali ◽  
V.M. Aita ◽  
A.M. Christiano
Keyword(s):  
Amino Acid ◽  
Hair Follicle ◽  
Nuclear Localization ◽  
Nuclear Matrix ◽  
Nuclear Localization Signal ◽  
Amino Acid Residues ◽  
Bipartite Nuclear Localization Signal ◽  
Hairless Gene ◽  
Fractionation Analysis ◽  
Localization Signal

Hair follicle cycling is an exquisitely regulated and dynamic process consisting of phases of growth, regression and quiescence. The transitions between the phases are governed by a growing number of regulatory proteins, including transcription factors. The hairless (hr) gene encodes a putative transcription factor that is highly expressed in the skin, where it appears to be an essential regulator during the regression of the catagen hair follicle. In hairless mice, as well as humans with congenital atrichia, the absence of hr gene function initiates a premature and abnormal catagen due to a dysregulation of apoptosis and cell adhesion, and defects in the signaling required for hair follicle remodeling. Here, we report structure-function studies of the hairless gene product, in which we identify a novel bipartite nuclear localization signal (NLS) of the form KRA(X13) PKR. Deletion analysis of the mouse hr gene mapped the NLS to amino acid residues 409–427. Indirect immunofluorescence microscopy of cells transiently transfected with hairless-green fluorescent fusion proteins demonstrated that these amino acid residues are necessary and sufficient for nuclear localization. Furthermore, nuclear fractionation analysis revealed that the hr protein is associated with components of the nuclear matrix.

scholarly journals Genetic Analysis of theEscherichia coliFtsZ·ZipA Interaction in the Yeast Two-hybrid System

2001 ◽  
Vol 276 (15) ◽  
pp. 11980-11987 ◽  
Author(s):  
Steven A. Haney ◽  
Elizabeth Glasfeld ◽  
Cynthia Hale ◽  
David Keeney ◽  
Zhizhen He ◽  
...  
Keyword(s):  
Hybrid System ◽  
Enzyme Linked Immunosorbent Assay ◽  
Wild Type ◽  
Yeast Two Hybrid ◽  
Conserved Sequence ◽  
Yeast Two Hybrid System ◽  
C Terminus ◽  
Two Hybrid

The recruitment of ZipA to the septum by FtsZ is an early, essential step in cell division inEscherichia coli. We have used polymerase chain reaction-mediated random mutagenesis in the yeast two-hybrid system to analyze this interaction and have identified residues within a highly conserved sequence at the C terminus of FtsZ as the ZipA binding site. A search for suppressors of a mutation that causes a loss of interaction (ftsZD373G) identified eight different changes at two residues within this sequence.In vitro, wild type FtsZ interacted with ZipA with a high affinity in an enzyme-linked immunosorbent assay, whereas FtsZD373Gfailed to interact. Two mutant proteins examined restored this interaction significantly.In vivo, the alleles tested are significantly more toxic than the wild typeftsZand cannot complement a deletion. We have shown that a fusion, which encodes the last 70 residues of FtsZ in the two-hybrid system, is sufficient for the interaction with FtsA and ZipA. However, when the wild type sequence is compared with one that encodes FtsZD373G, no interaction was seen with either protein. Mutations surrounding Asp-373 differentially affected the interactions of FtsZ with ZipA and FtsA, indicating that these proteins bind the C terminus of FtsZ differently.

Sign in / Sign up

Export Citation Format

Share Document