Evaluación del tiempo de inducción y la concentración de metanol en la expresión de L-asparaginasa II de Saccharomyces cerevisiae usando Pichia pastoris (Muts)
Omar Pillaca-Pullo, Karin Torres, Marcela Pimenta, Adalberto Pessoa-Jr & Michele Vitolo
Facultad de Ciencias Farmacéuticas – Universidad de São Paulo (Brasil), 0550-8000
DOI: https://doi.org/10.33017/RevECIPeru2015.0020/
Resumen
La levadura metilotrófica Pichia pastoris es ampliamente usada como un sistema eucariota para expresar proteínas recombinantes. Más de 500 proteínas recombinantes fueron expresas por P. pastoris con niveles de expresión que alcanzan hasta el 80% de proteínas totales secretadas y hasta 30% de proteínas totales de la célula. Existen tres fenotipos de P. pastoris clasificados de acuerdo con su capacidad de metabolizar metanol, el fenotipo MutS crece lentamente en medios con metanol por lo que generalmente se usan bajas concentraciones de metanol y tiempo de inducción prolongados. Por esta razón, el control de las condiciones de cultura como la concentración del inductor y el tiempo de inducción son factores importantes tanto para el crecimiento de la levadura como para producción de la proteína ya que este sistema es controlado por el promotor AOX inducido con metanol. Por otro lado, L-asparaginase (EC. 3.5.1.1) es un importante biofármaco usado en el tratamiento de leucemia linfoblástica aguda (ALL), la enzima comúnmente utilizada en la terapéutica es procedente de bacterias, estas han demostrado buena actividad, pero causan muchas reacciones inmunológicas severas en los pacientes tratados. La búsqueda de L-asparaginasa procedente y expresada en organismos eucariotas se abre como una posibilidad para reducir las reacciones adversas. En este estudio fueron evaluados el tiempo de inducción (24 - 120 horas) y la concentración de inductor (0.25, 0.5 y 1.0%). Los datos mostraron que la condición de mayor expresión de L-asparaginasa II de Saccharomyces cerevisiae después de 48 horas de inducción con 1,0% de metanol (~ 25 U.g-1). Finalmente se recomienda evaluar dicha producción en biorreactor donde se lleve un control adecuado de otras variables importantes como el pH del cultivo y la concentración de oxígeno en el medio.
Descriptores: Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, L-asparaginase, Metanol.
Abstract
The methylotrophic yeast Pichia pastoris is widely used as a eukaryotic system for expressing recombinant proteins. Over 500 recombinant proteins were expressed in P. pastoris with expression levels reaching up to 80% of total secreted proteins and up to 30% total cell proteins. There are three phenotypes of P. pastoris classified according to their ability to metabolize methanol, phenotype MutS grows slowly on media containing methanol at generally low concentrations of methanol and longer induction time are used. Therefore, the control of culture conditions such as concentration of the inducer and the induction time are important factors for both yeast growth and for production of the protein since this system is controlled by the AOX promoter induced with methanol. Furthermore, L-asparaginase (EC. 3.5.1.1) is an important biopharmaceutical used to treat acute lymphoblastic leukemia (ALL), the enzyme commonly used in the therapy is from bacteria, these have shown good activity but cause many severe immune reactions in patients. The search for L-asparaginase derived and expressed in eukaryotic organisms opens a possibility to reduce adverse reactions. In this study they were evaluated the induction time (24-120 hours) and inducer concentration (0.25, 0.5 and 1.0% v/v). The data showed that the condition of increased expression of L-asparaginase II from Saccharomyces cerevisiae after 48 hours’ induction with 1.0% methanol (~ 25 U.g-1). Finally, it is recommended to evaluate this production in bioreactor where adequate control of other important variables such as pH of the culture and the concentration of oxygen in the medium is carried.
Keywords: Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, L-asparaginase, Metanol.
Ktr1p is an α-1,2-mannosyltransferase of Saccharomyces cerevisiae. Comparison of the enzymic properties of soluble recombinant Ktr1p and Kre2p/Mnt1p produced in Pichia pastoris
