Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui senyawa bioaktif antimikroba ekstrak daun Sembukan (Paederia foetida L.) yang memiliki efektifitas terhadap Staphylococcus aureus dengan metode Bioautografi. Bahan uji dari penelitian ini adalah daun sembukan (Paederia foetida L.) dan sampel yang digunakan adalah Staphylococcus aureus. Berdasarkan hasil penelitian yang telah dilakukan maka dapat disimpulkan bahwa Uji Senyawa Bioaktif Ekstrak Daun Sembukan (Paederia foetida L.) dapat memberikan efektifitas terhadap pertumbuhan Staphylococcus aureus pada ekstrak eter daun sembukan dengan nilai Rf 0,85 dengan zona hambat 4,75 mm, nilai Rf 0,82 zona hambat 6,5 mm, nilai Rf 0, 84 zona hambat 6,25 mm dan ekstrak n-Butanol nilai Rf 0,35 dengan zona hambat 5,25 mm, nilai Rf 0,47 zona hambat 6,75 mm, nilai Rf 0,37 zona hambat 9,5 mm.Kata kunci : Daun Sembukan (Paederia foetida L.), Staphylococcus aureus, Bioautografi