Novel Multiplex and Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) Assays for Rapid Species and Mating-Type Identification of Oculimacula acuformis and O. yallundae (Causal Agents of Cereal Eyespot), and Application for Detection of Ascospore Dispersal and in planta Use

Eyespot, caused by the related fungal pathogens Oculimacula acuformis (OA) and O. yallundae (OY), is an important cereal stem-base disease in temperate parts of the world. Both species are dispersed mainly by splash-dispersed conidia but are also known to undergo sexual reproduction yielding apothecia containing ascospores. Field diagnosis of eyespot can be challenging with other pathogens causing similar symptoms, which complicates eyespot management strategies. Differences between OA and OY (e.g. host pathogenicity and fungicide sensitivity) require that both be targeted for effective disease management. Here, we develop and apply two molecular methods for species-specific and mating-type (MAT1-1 or MAT1-2) discrimination of OA and OY isolates. First, a multiplex PCR-based diagnostic assay targeting the MAT idiomorph region was developed allowing simultaneous determination of both species and mating type. This multiplex-PCR assay was successfully applied to type a global collection of isolates. Second, the development of loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assays targeting beta-tubulin sequences is described, which allow fast (<9 min) species-specific discrimination of global OA and OY isolates. The LAMP assay can detect very small amounts of target DNA (1 pg) and was successfully applied in planta. In addition, mating-type specific LAMP assays were also developed for rapid (<12 min) genotyping of OA and OY isolates. Finally, the multiplex PCR-based diagnostic was applied, in conjunction with spore trapping in field experiments, to provide evidence of the wind dispersal of ascospores from a diseased crop. The results indicate an important role of the sexual cycle in the dispersal of eyespot.

Wykorzystanie markerów molekularnych i fenotypowych do identyfikacji genów odporności pszenicy na łamliwość źdźbła powodowaną przez Oculimacula yallundae i O. acuformis

Łamliwość źdźbła to jedna z ważniejszych chorób pszenicy uprawnej (Triticum aestivum L.) powodowana przez dwa grzyby patogeniczne Oculimacula yallundae i Oculimacula acuformis. Istnieje kilka źródeł odporności na ten patogen, lecz jak dotąd tylko dwa geny Pch1 i Pch2 zostały przniesione do pszenicy uprawnej i warunkują odporność. Wybranie najkorzystniejszych markerów molekularnych dla określenia obecności genów odporności na łamliwość źdźbła u pszenicy może poprawić skuteczność i dokładność przy wyborze genotypów odpornych na tę chorobę. Celem pracy było określenie efektywności markerów molekularnych i markera izoenzymatycznego dla genów Pch1 i Pch2 oraz wytypowanie genotypów pszenicy ozimej o podwyższonej odporności w odniesieniu do porażenia roślin w testach inokulacyjnych przeprowadzonych w fazie siewki oraz rośliny dojrzałej. Materiał badawczy stanowiło 159 linii hodowlanych pszenicy ozimej oraz pięć odmian kontrolnych: Artist, Kilimanjaro, Kometa, Patras i Rendezvous. Do identyfikacji genów odporności wykorzystano pięć markerów, trzy do identyfikacji genu Pch1 (EpD1b, XustSSR2001-7DL, Xorw1) oraz dwa dla genu Pch2 (Xcfa2040, Xwmc525). Biorąc pod uwagę analizę molekularną genów, wyniki inokulacji siewek oraz wyniki porażenia źdźbeł dojrzałych roślin, stwierdzono brak objawów porażenia źdźbeł u linii/odmian pszenicy ozimej, u których zidentyfikowano oba geny Pch1 i Pch2. Stwierdzono u nich również najniższe porażenie siewek. Najwyższy procent porażonych źdźbeł odnotowano u genotypów, gdzie nie stwierdzono genów Pch1 i Pch2. U tych genotypów zaobserwowano również najwyższe porażenie w teście siewkowym. Wykazano, że obecność genów Pch1 i Pch2 lub ich brak nie wpływała istotnie na plon ziarna oraz na masę tysiąca ziarniaków (MTZ). U genotypów z genami Pch1 i Pch2 stwierdzono nieznacznie wyższe wartości dla obu parametrów technologicznych.