Cambios bioquímicos generados en la vitelogénesis y desarrollo embrionario de arañas

En los animales ovíparos, la vitelogénesis representa el proceso mediante el cual las hembras acumulan en los oocitos todos los recursos necesarios que finalmente serán transferidos a los huevos. Este proceso en el que intervienen diferentes tipos de biomoléculas garantiza que todos los recursos acumulados permitan el desarrollo adecuado de la descendencia. A pesar de la importancia de este proceso que fue ampliamente estudiado en distintos grupos de artrópodos, el conocimiento sobre el mismo es verdaderamente escaso para un grupo tan diverso e importante como son las arañas. Una característica destacable de las arañas es que sus huevos nunca quedan expuestos directamente al ambiente, siendo protegidos por un cocón de seda que las mismas madres construyen. Debido a la presencia de esta estructura, dentro de este cocón de seda también transcurren el desarrollo de estadios postembrionarios. De esta manera, todos los recursos acumulados durante la vitelogénesis serán necesarios para suplir no solo los requerimientos energéticos del desarrollo embrionario, sino también los de los estadios postembrionarios y las actividades de emergencia, dispersión, y otras actividades postemergentes hasta que los juveniles puedan alimentarse. A partir de lo expuesto, el objetivo general de este trabajo de tesis fue analizar el proceso de vitelogénesis en la especie Polybetes pythagoricus determinando cuali y cuantitativamente los recursos principales que las hembras almacenan y destinan a los huevos y analizando las variaciones de las principales biomoléculas en los órganos implicados en la formación del vitelo. Asimismo, con el propósito de vincular el proceso de vitelogénesis con el proceso de desarrollo, se analizó el consumo de los distintos recursos durante el desarrollo embrionario, postembrionario y estadios postemergentes de P. pythagoricus. En primer lugar, se determinó a partir de un análisis morfológico, morfométrico e histológico los distintos estadios de la vitelogénesis analizados. Las hembras se clasificaron en cuatro estadios: previtelogénicas, vitelogénicas tempranas, vitelogénicas tardías y, luego de la puesta, postvitelogénicas. A partir de este análisis se observó un aumento del peso corporal de las hembras y de los ovarios. A partir de estas medidas, se calculó el índice gonadosomático que resultó ser un buen parámetro para determinar el estado reproductivo de las hembras. Por otra parte, se observó un aumento en el diámetro de los oocitos y la acumulación y aumento de tamaño de los gránulos de vitelo. Posteriormente, aplicando técnicas cromatográficas, se realizó la caracterización de los lípidos y ácidos grasos de los principales órganos y/o tejidos de las hembras de los diferentes estadios analizados. Se analizó la variación de estos componentes durante la vitelogénesis observándose una acumulación considerable de lípidos en los ovarios. Dentro de estos componentes, se destacó la acumulación de fosfatidiletanolamina y, en menor medida, de fosfatidilcolina y triacilgliceroles, como también se observó un aumento en el contenido de ácidos grasos poliinsaturados. Además, se pudo observar que los huevos presentaban el mismo perfil lipídico que los ovarios, siendo a su vez comparable con el contenido de lípidos previamente reportado para las lipovitelinas de esta especie. Luego de la puesta, se observó una disminución en el contenido total de lípidos en todos los órganos y/o tejidos analizados de las hembras postvitelogénicas, alcanzando valores comparables a los de las hembras previtelogénicas y machos. Durante este período, se observó una disminución particular en el contenido de los triacilgliceroles en los divertículos intestinales de las hembras, lípidos que fueron previamente destacados como componentes mayoritarios de este órgano. Mediante la aplicación de técnicas colorimétricas y electroforéticas, se cuantificó el contenido de proteínas y se determinó su variación durante la vitelogénesis. A partir de este análisis se pudo observar la acumulación progresiva de varias proteínas. Mediante la aplicación de inmunoensayos se demostró la presencia de ciertas proteínas que compartían identidad inmunológica con las lipovitelinas y la hemocianina, la cual se acumuló progresivamente en los ovarios. Mediante el análisis de la secuencia de aminoácidos del extremo N-terminal se pudo comprobar la presencia de hemocianina en los huevos, la cual se distinguió como componente de una de las lipovitelinas. A partir de los resultados obtenidos con la metodología aplicada, se pudo determinar que los componentes proteicos de las lipovitelinas de P. pythagoricus presentan polipéptidos que provendrían principalmente del ovario y, en menor medida, del aporte de los divertículos intestinales y de la hemolinfa (hemocianina). Aplicando las mismas técnicas previamente mencionadas, se determinó el consumo de los diferentes recursos durante el desarrollo embrionario, postembrionario y en estadios emergentes de P. pythagoricus. Para esto se determinó cuali y cuantitativamente la variación de los lípidos y ácidos grasos en los diferentes estadios, los cuales se compararon con estadios juveniles de desarrollo avanzado y con adultos. A partir de este análisis, se determinó que los fosfolípidos son el principal recurso lipídico consumido durante el desarrollo postembrionario, mientras que los triacilgliceroles se consumen luego de que los juveniles emergen de la ooteca y se dispersan. A su vez, durante estos períodos de consumo se observó un aumento en la concentración de ácidos grasos libres. También se analizó y cuantificó el contenido de glucógeno, el cual representó menos del 1% de las reversas y se consumió de manera gradual a partir del período postembrionario. También se determinó y cuantificó el contenido de las reservas proteicas de las lipovitelinas que se consumieron de manera gradual y diferencial durante el desarrollo, agotándose luego de la dispersión. Por último, se cuantificó el contenido de hemocianina el cual aumentó a partir de estadios postembrionarios avanzados. Finalmente, los resultados obtenidos en el marco de esta tesis han brindado una nueva fuente de información que amplia el conocimiento acerca de P. pythagoricus, un modelo de araña en el que se han analizado por más de 20 años diferentes aspectos bioquímicos y fisiológicos. De esta manera, a través de distintos abordajes metodológicos, esta tesis ha permitido reconocer los diferentes recursos que las hembras destinan a la producción de huevos y el consumo de los mismos durante el desarrollo. Este aporte permite vincular por primera vez para un modelo de araña dos procesos biológicos esenciales, como son la vitelogénesis y el desarrollo para este grupo de artrópodos.

First study on lipid dynamics during the female reproductive cycle of Polybetes pythagoricus (Araneae: Sparassidae)

Spiders are valuable to humans, not only for their role in health but also as biologic pest controllers. In oviparous species, lipids are the main energy source for embryo development and the growth and survival of larvae. Using the spider Polybetes pythagoricus (Holmberg, 1875) as an experimental model, we studied the fluctuations in lipids and fatty acids occurring in tissues related to vitellogenesis. Different reproductive stages (previtellogenesis, early vitellogenesis, vitellogenesis, and postvitellogenesis) were determined histologically. Gonadosomatic and hepatosomatic indices were first used in spiders. The midgut diverticula proved to be the organ with the highest lipid concentration, with triacylglycerols as the major component. Phospholipids were the principal lipids transported. In vitellogenesis, a major accumulation of lipids occurred in the ovary, principally phosphatidylethanolamine (41%); it probably synthesized in the midgut diverticula before being released into the hemolymph for transport and accumulation in the ovary. Phosphatidylethanolamine is possibly involved in maintaining membrane fluidity and in the function of the electron transport chain. The principal fatty acids in the different organs were palmitic, stearic, oleic, and linoleic acids. During vitellogenesis, the ovaries become enriched in polyunsaturated fatty acids. The lipid patterns in the male midgut diverticula, muscle, and hemolymph were similar to those of the previtellogenic or postvitellogenic females.

Biochemical and structural characterization of a novel arginine kinase from the spider Polybetes pythagoricus

Energy buffering systems are key for homeostasis during variations in energy supply. Spiders are the most important predators for insects and therefore key in terrestrial ecosystems. From biomedical interest, spiders are important for their venoms and as a source of potent allergens, such as arginine kinase (AK, EC 2.7.3.3). AK is an enzyme crucial for energy metabolism, keeping the pool of phosphagens in invertebrates, and also an allergen for humans. In this work, we studied AK from the Argentininan spider Polybetes pythagoricus (PpAK), from its complementary DNA to the crystal structure. The PpAK cDNA from muscle was cloned, and it is comprised of 1068 nucleotides that encode a 384-amino acids protein, similar to other invertebrate AKs. The apparent Michaelis-Menten kinetic constant (Km) was 1.7 mM with a kcat of 75 s−1. Two crystal structures are presented, the apoPvAK and PpAK bound to arginine, both in the open conformation with the active site lid (residues 310–320) completely disordered. The guanidino group binding site in the apo structure appears to be organized to accept the arginine substrate. Finally, these results contribute to knowledge of mechanistic details of the function of arginine kinase.

Bioquímica y fisiología de lipoproteínas en arácnidos

La especie Polybetes pythagoricus es representante de un género de arañas exclusivamente sudamericano, perteneciente al Suborden Araneomorpha, Familia Sparassidae, abundante en regiones tropicales y subtropicales. Por tratarse de una especie de fácil obtención, manipulación y mantenimiento, fue elegida como modelo de estudio para este trabajo de tesis. En el presente estudio, se buscó ampliar el conocimiento a nivel estructural de la lipoproteína hemolinfática de muy alta densidad (VHDL) de dicha araña, se analizaron aspectos bioquímicos y fisiológicos estudiando el rol de las lipoproteínas de esta especie en la dinámica de la circulación de lípidos, y el transporte de éstos lípidos, desde y hacia los tejidos; y por último se estudió la presencia y estructura de dos lipovitelinas de huevos.