Tetrasiklin merupakan antibiotik yang banyak digunakan baik untuk pengobatan pada manusia maupun veteriner serta merupakan salah satu antibiotik yang persisten di lingkungan. Penelitian ini bertujuan untuk mengembangkan dan memvalidasi metode analisis tetrasiklin dalam sampel air limbah dan menggunakannya untuk menetapkan kadar tetrasiklin dalam sampel air limbah. Analisis dilakukan dengan mengekstraksi sampel menggunakan SPE C18 dan dilanjutkan tahap determinasi menggunakan metode High Performance Liquid Chromatography yang dilengkapi dengan detektor foto-dioda (HPLC-PDA) yang sebelumnya telah dioptimasi dan divalidasi. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa metode analisis yang dikembangkan cukup valid pada kisaran konsentrasi tetrasiklin 0,21 – 3.16 µg/mL yang ditunjukkkan dengan koefisien korelasi sebesar 0,999, batas deteksi dan kuantifikasi berturut-turut 0,102 µg/mL dan 0,340 µg/mL dengan kepresisisan 5,2 -5,6% dan 4,8-5,7% (berturut-turut intra-day dan between-day) serta keakuratan 5,2 -5,6% dan 4,8-5,7% (berturut-turut intra-day dan between-day). Hasil penelitian ini juga menunjukkan bahwa tetrasiklin tidak terdeteksi dalam sampel air limbah yang dianalisis.