Pathways and assays for DNA double-strand break repair by homologous recombination

2019 ◽  
Vol 51 (9) ◽  
pp. 879-889 ◽  
Author(s):  
Jinbao Li ◽  
Huize Sun ◽  
Yulin Huang ◽  
Yali Wang ◽  
Yuyan Liu ◽  
...  
Keyword(s):  
Homologous Recombination ◽  
Strand Break ◽  
Dna Helicase ◽  
Single Strand ◽  
Homology Search ◽  
End Joining ◽  
Single Strand Annealing ◽  
D Loop ◽  
Non Homologous End Joining ◽  
Strand Annealing

AbstractDouble strand breaks (DSBs) are the most detrimental type of DNA damage that must be repaired to ensure genome integrity and cell survival. Unrepaired or improperly repaired DSBs can potentially cause tumorigenesis or cell death. DSBs are primarily repaired by non-homologous end joining or homologous recombination (HR). The HR pathway is initiated by processing of the 5′-end of DSBs to generate 3′-end single-strand DNA (ssDNA). Furthermore, the intermediate is channeled to one of the HR sub-pathways, including: (i) double Holliday junction (dHJ) pathway, (ii) synthesis-dependent strand annealing (SDSA), (iii) break-induced replication (BIR), and (iv) single-strand annealing (SSA). In the dHJ sub-pathway, the 3′-ssDNA coated with Rad51 recombinase performs homology search and strand invasion, forming a displacement loop (D-loop). Capture of the second end by the D-loop generates a dHJ intermediate that is subsequently dissolved by DNA helicase or resolved by nucleases, producing non-crossover or crossover products. In SDSA, the newly synthesized strand is displaced from the D-loop and anneals to the end on the other side of the DSBs, producing non-crossovers. In contrast, BIR repairs one-end DSBs by copying the sequence up to the end of the template chromosome, resulting in translocation or loss of heterozygosity. SSA takes place when resection reveals flanking homologous repeats that can anneal, leading to deletion of the intervening sequences. A variety of reporter assays have been developed to monitor distinct HR sub-pathways in both Saccharomyces cerevisiae and mammals. Here, we summarize the principles and representative assays for different HR sub-pathways with an emphasis on the studies in the budding yeast.

scholarly journals RecF and RecR Play Critical Roles in the Homologous Recombination and Single-Strand Annealing Pathways of Mycobacteria

2015 ◽  
Vol 197 (19) ◽  
pp. 3121-3132 ◽  
Author(s):  
Richa Gupta ◽  
Stewart Shuman ◽  
Michael S. Glickman
Keyword(s):  
Dna Repair ◽  
Homologous Recombination ◽  
Strand Break ◽  
Single Strand ◽  
Central Position ◽  
End Joining ◽  
Dna Double Strand Break ◽  
Single Strand Annealing ◽  
Strand Annealing

ABSTRACTMycobacteria encode three DNA double-strand break repair pathways: (i) RecA-dependent homologous recombination (HR), (ii) Ku-dependent nonhomologous end joining (NHEJ), and (iii) RecBCD-dependent single-strand annealing (SSA). Mycobacterial HR has two presynaptic pathway options that rely on the helicase-nuclease AdnAB and the strand annealing protein RecO, respectively. Ablation ofadnABorrecOindividually causes partial impairment of HR, but loss ofadnABandrecOin combination abolishes HR. RecO, which can accelerate annealing of single-stranded DNAin vitro, also participates in the SSA pathway. The functions of RecF and RecR, which, in other model bacteria, function in concert with RecO as mediators of RecA loading, have not been examined in mycobacteria. Here, we present a genetic analysis ofrecFandrecRin mycobacterial recombination. We find that RecF, like RecO, participates in the AdnAB-independent arm of the HR pathway and in SSA. In contrast, RecR is required for all HR in mycobacteria and for SSA. The essentiality of RecR as an agent of HR is yet another distinctive feature of mycobacterial DNA repair.IMPORTANCEThis study clarifies the molecular requirements for homologous recombination in mycobacteria. Specifically, we demonstrate that RecF and RecR play important roles in both the RecA-dependent homologous recombination and RecA-independent single-strand annealing pathways. Coupled with our previous findings (R. Gupta, M. Ryzhikov, O. Koroleva, M. Unciuleac, S. Shuman, S. Korolev, and M. S. Glickman, Nucleic Acids Res 41:2284–2295, 2013,http://dx.doi.org/10.1093/nar/gks1298), these results revise our view of mycobacterial recombination and place the RecFOR system in a central position in homology-dependent DNA repair.

Διερεύνηση παραγόντων που συμβάλλουν στη γονιδιωματική σταθερότητα με τεχνικές λειτουργικής μικροσκοπίας ζωντανών κυττάρων

2019 ◽  
Author(s):  
Ανδρέας Παναγόπουλος
Keyword(s):  
Homologous Recombination ◽  
Single Strand ◽  
End Joining ◽  
Single Strand Annealing ◽  
Non Homologous End Joining ◽  
Strand Annealing ◽  
Break Induced Replication ◽  
Uv C

Η γονιδιωματική σταθερότητα διατηρείται μέσω του συντονισμού μεταξύ των μηχανισμών του φυσιολογικού κυτταρικού κύκλου και των μηχανισμών απόκρισης σε βλάβη στο γενετικό υλικό. Οι παράγοντες που διαδραματίζουν κομβικό ρόλο στη διασύνδεση των συγκεκριμένων μηχανισμών καθίστανται ιδιαίτερα σημαντικοί. Χαρακτηριστικά παραδείγματα αποτελούν τα Cdt1 και Cdc6 που συμβάλλουν στην αδειοδότηση της αντιγραφής του γενετικού υλικού. Μάλιστα, οι εν λόγω παράγοντες διαδραματίζουν κομβικό ρόλο στον καρκίνο όπου η υπερέκφρασή τους οδηγεί σε γονιδιωματική αστάθεια και επικράτηση κυττάρων με ογκογονικές ιδιότητες. Επιπρόσθετα, η σημαντικότητα τους υποδεικνύεται και από το γεγονός πως ένα ευρύ φάσμα μηχανισμών είναι υπεύθυνο για τη ρύθμισή τους τόσο κατά το φυσιολογικό κυτταρικό κύκλο όσο και μετά από βλάβη στο γενετικό υλικό.Η περιοδική πρωτεόλυση πρωτεϊνών είναι ιδιαίτερα σημαντική για τη διατήρηση της κυτταρικής φυσιολογίας. Η διαδικασία της πρωτεόλυσης πραγματοποιείται μέσω της πρόσδεσης αλυσίδων ουβικουϊτίνης στις πρωτεΐνες-υποστρώματα, οι οποίες στη συνέχεια καθίστανται στόχοι αποικοδόμησης από το πρωτεάσωμα. Η λιγάση της ουβικουϊτίνης CRL4Cdt2 αποτελεί ένα σύμπλοκο υπεύθυνο για την ουβικουϊτινιλίωση μεγάλου αριθμού μορίων που συμβάλλουν στην πρόοδο του κυτταρικού κύκλου. Η ρύθμιση μέσω αυτού του συμπλόκου πραγματοποιείται μέσω της πρόσδεσης του υποστρώματος στο PCNA που βρίσκεται στο DNA. Το CRL4Cdt2 είναι ενεργό κατά τη διάρκεια της S φάσης και μετά από βλάβη στο γενετικό υλικό. Παρά το γεγονός πως η εν λόγω λιγάση της ουβικουϊτίνης αποτελεί έναν κεντρικό ρυθμιστή της γονιδιωματικής σταθερότητας εντούτοις ο μοριακός μηχανισμός αναγνώρισης υποστρώματος δεν είχε διαλευκανθεί πλήρως. Το μέχρι πρόσφατα επικρατές μοντέλο όριζε πως το CRL4Cdt2 στρατολογείται στη χρωματίνη αφού πρώτα έχει σχηματιστεί το σύμπλοκο PCNA-υπόστρωμα. Ερευνητικά δεδομένα από διάφορες ομάδες υποδείκνυαν ένα διαφορετικό μηχανισμό σε σχέση με το συγκεκριμένο μοντέλο. Στην παρούσα διατριβή, με τη χρήση μεταλλαγμάτων του υποδοχέα υποστρώματος της λιγάσης, Cdt2 και ακτινοβολίας UV-C καταφέραμε να διαπιστώσουμε πως η συσσώρευση στην περιοχή της βλάβης πραγματοποιείται μέσω του καρβοξυ-τελικού τμήματος της πρωτεΐνης και συγκεκριμένα μέσω μοτίβου PIP-box που εδράζεται στο καρβόξυ-τελικό άκρο. Τα συγκεκριμένα δεδομένα οδήγησαν στην περιγραφή ενός νέου μοντέλου για το μηχανισμό αναγνώρισης υποστρώματος όπου η λιγάση και το υπόστρωμα συσσωρεύονται ανεξάρτητα στο PCNA. Στη συνέχεια ακολουθεί η αναγνώριση και η ουβικουϊτινιλίωση του υποστρώματος το οποίο στοχεύεται για πρωτεόλυση.Οι διπλές θραύσεις στο γενετικό υλικό είναι μία από τις πιο επιζήμιες βλάβες και μπορούν να προκληθούν από ενδογενείς διεργασίες ή εξωγενείς παράγοντες. Αν δεν επιδιορθωθούν ή επιδιορθωθούν με λανθασμένο τρόπο μπορεί να προκαλέσουν γονιδιωματική αστάθεια. Οι κύριοι επιδιορθωτικοί μηχανισμοί που έχουν αναπτυχθεί προκειμένου να αντιμετωπιστούν οι εν λόγω βλάβες είναι η Μη-Ομόλογη Σύνδεση των Άκρων (Non-Homologous End Joining, NHEJ) που λειτουργεί καθ' όλη τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου και είναι επιρρεπής σε λάθη και ο Ομόλογος Ανασυνδυασμός (Homologous Recombination, HR) που λειτουργεί μόνο κατά τις S και G2 φάσεις του κυτταρικού κύκλου και επιδιορθώνει τις διπλές θραύσεις με υψηλή πιστότητα. Όταν οι συγκεκριμένοι μηχανισμοί παρουσιάζουν αδυναμία επιδιόρθωσης των βλαβών στο γενετικό υλικό τότε η επιδιόρθωση επαφίεται στους εναλλακτικούς επιδιορθωτικούς μηχανισμούς που περιλαμβάνουν την Εναλλακτική Σύνδεση των Άκρων (Alternative Non-Homologous End Joining, A-NHEJ) με κύριο υπομονοπάτι τη Σύνδεση των Άκρων ρυθμιζόμενη από Μικρο-ομολογία (Microhomology Mediated End Joining, MMEJ), τη Σύνδεση Μονού Κλώνου (Single Strand Annealing, SSA) και την Επιδιόρθωση Αντιγραφής Επαγόμενης από Θραύση (Break Induced Replication, BIR). Τα συγκεκριμένα επιδιορθωτικά μονοπάτια αν και βελτιώνουν τις πιθανότητες ενός κυττάρου για επιβίωση μετά από βλάβη εντούτοις παρουσιάζονται ιδιαίτερα επιρρεπή σε λάθη. Προηγούμενα ερευνητικά δεδομένα του εργαστηρίου υπέδειξαν την ταχύτατη συσσώρευση του Cdt1 στην περιοχή της εντοπισμένης βλάβης από UV-A παλμικό laser. Στην παρούσα διατριβή πραγματοποιήθηκε εκτεταμένη μελέτη της πιθανής εμπλοκής του Cdt1 στην επιδιόρθωση των διπλών θραύσεων. Τα ερευνητικά δεδομένα από πειράματα με κυτταρικά συστήματα αναφοράς φθορισμού υποδεικνύουν πως ο συγκεκριμένος παράγοντας συμμετέχει στα βασικά μονοπάτια επιδιόρθωσης NHEJ, HR καθώς και στα εναλλακτικά μονοπάτια SSA και BIR. Πειράματα που πραγματοποιήθηκαν με ετοποσίδιο, neocarzinostatin και ακτίνες Χ προκειμένου να διαλευκανθεί το ακριβές σημείο εμπλοκής του Cdt1 στα μονοπάτια επιδιόρθωσης των διπλών θραύσεων δεν οδήγησαν σε κάποιο ξεκάθαρο συμπέρασμα.Στην παρούσα διατριβή διαπιστώθηκε για πρώτη φορά πως ο αδειοδοτικός παράγοντας Cdc6 διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην επιδιόρθωση των διπλών θραύσεων στο γενετικό υλικό. Συγκεκριμένα με τη χρήση UV-A παλμικού laser διαπιστώθηκε πως το Cdc6 συσσωρεύεται ταχύτατα στην περιοχή της εντοπισμένης βλάβης. Πειράματα με ετοποσίδιο και neocarzinostatin καθώς και με κυτταρικά συστήματα αναφοράς φθορισμού υπέδειξαν πως το Cdc6 εμπλέκεται στο μονοπάτι NHEJ και συγκεκριμένα στα αρχικά στάδια κατά τη συσσώρευση των παραγόντων 53BP1 και RIF1 στα σημεία της βλάβης. Στον αντίποδα η συσσώρευση στα σημεία βλάβης των παραγόντων του μονοπατιού HR, pRPA και Rad51 δεν επηρεάζεται από το Cdc6. Τα συγκεκριμένα πειράματα υπέδειξαν επίσης πως το Cdc6 εμπλέκεται στην ενεργοποίηση της κινάσης ATM χωρίς ωστόσο να επηρεάζει τη φωσφορυλίωση της ιστόνης H2AX. Τέλος, στην παρούσα διατριβή διαπιστώθηκε πως η απουσία του Cdc6 οδηγεί σε ευαισθητοποίηση των καρκινικών κυττάρων σε επώαση με γενοτοξικούς παράγοντες, γεγονός που υποδεικνύει πως η εμπλοκή του Cdc6 στα μονοπάτια απόκρισης στη βλάβη είναι σημαντική για την επιβίωση των κυττάρων. Παράλληλα, υποδεικνύει πως η αποσιώπηση του Cdc6 μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε θεραπευτικές προσεγγίσεις για την καταπολέμηση του καρκίνου.

scholarly journals Analysis of BRCA1 Variants in Double-Strand Break Repair by Homologous Recombination and Single-Strand Annealing

2013 ◽  
Vol 34 (3) ◽  
pp. 439-445 ◽  
Author(s):  
William I. Towler ◽  
Jie Zhang ◽  
Derek J. R. Ransburgh ◽  
Amanda E. Toland ◽  
Chikashi Ishioka ◽  
...  
Keyword(s):  
Homologous Recombination ◽  
Strand Break ◽  
Double Strand Break ◽  
Single Strand ◽  
Double Strand Break Repair ◽  
Single Strand Annealing ◽  
Break Repair ◽  
Strand Annealing

scholarly journals Increased single-strand annealing rather than non-homologous end-joining predicts hereditary ovarian carcinoma

Oncotarget ◽  
2017 ◽  
Vol 8 (58) ◽  
pp. 98660-98676 ◽  
Author(s):  
Miriam Deniz ◽  
Tatiana Romashova ◽  
Sarah Kostezka ◽  
Anke Faul ◽  
Theresa Gundelach ◽  
...  
Keyword(s):  
Ovarian Carcinoma ◽  
Single Strand ◽  
End Joining ◽  
Single Strand Annealing ◽  
Non Homologous End Joining ◽  
Strand Annealing

scholarly journals Single-Strand Annealing in Cancer

2021 ◽  
Vol 22 (4) ◽  
pp. 2167
Author(s):  
Janusz Blasiak
Keyword(s):  
Dna Repair ◽  
Synthetic Lethality ◽  
Single Strand ◽  
Repair System ◽  
Dna Double Strand Breaks ◽  
End Joining ◽  
Cancer Pathogenesis ◽  
Single Strand Annealing ◽  
Non Homologous End Joining ◽  
Strand Annealing

DNA double-strand breaks (DSBs) are among the most serious forms of DNA damage. In humans, DSBs are repaired mainly by non-homologous end joining (NHEJ) and homologous recombination repair (HRR). Single-strand annealing (SSA), another DSB repair system, uses homologous repeats flanking a DSB to join DNA ends and is error-prone, as it removes DNA fragments between repeats along with one repeat. Many DNA deletions observed in cancer cells display homology at breakpoint junctions, suggesting the involvement of SSA. When multiple DSBs occur in different chromosomes, SSA may result in chromosomal translocations, essential in the pathogenesis of many cancers. Inhibition of RAD52 (RAD52 Homolog, DNA Repair Protein), the master regulator of SSA, results in decreased proliferation of BRCA1/2 (BRCA1/2 DNA Repair Associated)-deficient cells, occurring in many hereditary breast and ovarian cancer cases. Therefore, RAD52 may be targeted in synthetic lethality in cancer. SSA may modulate the response to platinum-based anticancer drugs and radiation. SSA may increase the efficacy of the CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas9 (CRISPR associated 9) genome editing and reduce its off-target effect. Several basic problems associated with SSA, including its evolutionary role, interplay with HRR and NHEJ and should be addressed to better understand its role in cancer pathogenesis and therapy.

Multi-Pathway DNA Double-Strand Break Repair Reporters Reveal Extensive Cross-Talk Between End-Joining, Single Strand Annealing, and Homologous Recombination

2021 ◽  
Author(s):  
Bert van de Kooij ◽  
Alex Kruswick ◽  
Haico van Attikum ◽  
Michael B. Yaffe
Keyword(s):  
Homologous Recombination ◽  
Cross Talk ◽  
Single Strand ◽  
Repair Pathway ◽  
End Joining ◽  
Dsb Repair ◽  
Alu Elements ◽  
Single Strand Annealing ◽  
Strand Annealing ◽  
End Resection

DNA double-strand breaks (DSB) are repaired by multiple distinct pathways, with outcomes ranging from error-free repair to extensive mutagenesis and genomic loss. Repair pathway cross-talk and compensation within the DSB-repair network is incompletely understood, despite its importance for genomic stability, oncogenesis, and the outcome of genome editing by CRISPR/Cas9. To address this, we constructed and validated three fluorescent Cas9-based reporters, named DSB-Spectrum, that simultaneously quantify the contribution of multiple distinct pathways to repair of a DSB. These reporters distinguish between DSB-repair by error-free canonical non-homologous end-joining (c-NHEJ) versus homologous recombination (HR; reporter 1), mutagenic repair versus HR (reporter 2), and mutagenic end-joining versus single strand annealing (SSA) versus HR (reporter 3). Using these reporters, we show that inhibition of the essential c-NHEJ factor DNA-PKcs not only increases repair by HR, but also results in a substantial increase in mutagenic repair by SSA. We show that SSA-mediated repair of Cas9-generated DSBs can occur between Alu elements at endogenous genomic loci, and is enhanced by inhibition of DNA-PKcs. Finally, we demonstrate that the short-range end-resection factors CtIP and Mre11 promote both SSA and HR, whereas the long-range end-resection factors DNA2 and Exo1 promote SSA, but reduce HR, when both pathways compete for the same substrate. These new Cas9-based DSB-Spectrum reporters facilitate the rapid and comprehensive analysis of repair pathway crosstalk and DSB-repair outcome.

scholarly journals Mammalian RAD51 prevents non-conservative alternative end-joining and single strand annealing through non-catalytic mechanisms

2019 ◽  
Author(s):  
Ayeong So ◽  
Ali Muhammad ◽  
Catherine Chailleux ◽  
Laura Sesma Sanz ◽  
Sandrine Ragu ◽  
...  
Keyword(s):  
Single Strand ◽  
Dominant Negative ◽  
Dna Double Strand Breaks ◽  
End Joining ◽  
Step Model ◽  
Dominant Negative Form ◽  
Single Strand Annealing ◽  
Alternative End Joining ◽  
Non Homologous End Joining ◽  
Strand Annealing

AbstractThe selection of the DNA double-strand breaks (DSBs) repair pathway is decisive for genetic stability/instability. We proposed that it acts according to two successive steps: 1-canonical non-homologous end-joining (C-NHEJ) versus single-strand DNA (ssDNA) resection; 2- on ssDNA, gene conversion (GC) versus non-conservative single-strand annealing (SSA) or alternative end-joining (A-EJ).Using intramolecular substrates, we systematically analysed the equilibrium between the different DSB repair pathways. We show that ablation of RAD51 stimulated both SSA and A-EJ but did not stimulate C-NHEJ, validating the two-step model. Moreover, we found that two ATP-mutant dominant-negative forms of RAD51 that stimulated non-conservative repair, failed to load into damaged chromatin, clarifying the role of ATP in RAD51-mediated HR, also. In contrast, another dominant-negative form of RAD51, which retains its DNA binding capacities, repressed SSA and A-EJ, revealing two separable functions of RAD51 i.e. GC and non-conservative repair inhibition. In vitro assays show that the binding of RAD51 on both complementary ssDNA is required to block both spontaneous and RAD52-induced strand annealing. Therefore, RAD51 represses non-conservative repair (SSA and A-EJ), by inhibiting the annealing step through ssDNA occupancy, independently of the catalytic strand-exchange activity required for GC.

scholarly journals Rad51-Independent Interchromosomal Double-Strand Break Repair by Gene Conversion Requires Rad52 but Not Rad55, Rad57, or Dmc1

2007 ◽  
Vol 28 (3) ◽  
pp. 897-906 ◽  
Author(s):  
Thomas J. Pohl ◽  
Jac A. Nickoloff
Keyword(s):  
Gene Conversion ◽  
Strand Break ◽  
Double Strand Break ◽  
Single Strand ◽  
Homology Search ◽  
Wild Type ◽  
Dsb Repair ◽  
Single Strand Annealing ◽  
In The Wild ◽  
Break Induced Replication

ABSTRACT Homologous recombination (HR) is critical for DNA double-strand break (DSB) repair and genome stabilization. In yeast, HR is catalyzed by the Rad51 strand transferase and its “mediators,” including the Rad52 single-strand DNA-annealing protein, two Rad51 paralogs (Rad55 and Rad57), and Rad54. A Rad51 homolog, Dmc1, is important for meiotic HR. In wild-type cells, most DSB repair results in gene conversion, a conservative HR outcome. Because Rad51 plays a central role in the homology search and strand invasion steps, DSBs either are not repaired or are repaired by nonconservative single-strand annealing or break-induced replication mechanisms in rad51Δ mutants. Although DSB repair by gene conversion in the absence of Rad51 has been reported for ectopic HR events (e.g., inverted repeats or between plasmids), Rad51 has been thought to be essential for DSB repair by conservative interchromosomal (allelic) gene conversion. Here, we demonstrate that DSBs stimulate gene conversion between homologous chromosomes (allelic conversion) by >30-fold in a rad51Δ mutant. We show that Rad51-independent allelic conversion and break-induced replication occur independently of Rad55, Rad57, and Dmc1 but require Rad52. Unlike DSB-induced events, spontaneous allelic conversion was detected in both rad51Δ and rad52Δ mutants, but not in a rad51Δ rad52Δ double mutant. The frequencies of crossovers associated with DSB-induced gene conversion were similar in the wild type and the rad51Δ mutant, but discontinuous conversion tracts were fivefold more frequent and tract lengths were more widely distributed in the rad51Δ mutant, indicating that heteroduplex DNA has an altered structure, or is processed differently, in the absence of Rad51.

Sign in / Sign up

Export Citation Format

Share Document