Serotyping and detection of pathogenecity loci of environmental isolates of Legionella pneumophila using MALDI-TOF MS

Legionella spp. are widespread bacteria in aquatic environments with a growing impact on human health. Between the 61 species, Legionella pneumophila is the most prevalent in human diseases; on the contrary, Legionella non-pneumophila species are less detected in clinical diagnosis or during environmental surveillance due to their slow growth in culture and the absence of specific and rapid diagnostic/analytical tools. Reliable and rapid isolate identification is essential to estimate the source of infection, to undertake containment measures, and to determine clinical treatment. Matrix-assisted laser desorption ionization–time-of-flight mass spectrometry (MALDI–TOF MS), since its introduction into the routine diagnostics of laboratories, represents a widely accepted method for the identification of different bacteria species, described in a few studies on the Legionella clinical and environmental surveillance. The focus of this study was the improvement of MALDI–TOF MS on Legionella non-pneumophila species collected during Legionella nosocomial and community surveillance. Comparative analysis with cultural and mip-gene sequencing results was performed. Moreover, a phylogenetic analysis was carried out to estimate the correlations amongst isolates. MALDI–TOF MS achieved correct species-level identification for 45.0% of the isolates belonging to the Legionella anisa, Legionella rubrilucens, Legionella feeleii, and Legionella jordanis species, displaying a high concordance with the mip-gene sequencing results. In contrast, less reliable identification was found for the remaining 55.0% of the isolates, corresponding to the samples belonging to species not yet included in the database. The phylogenetic analysis showed relevant differences inside the species, regruped in three main clades; among the Legionella anisa clade, a subclade with a divergence of 3.3% from the main clade was observed. Moreover, one isolate, identified as Legionella quinlivanii, displayed a divergence of 3.8% from the corresponding reference strain. However, these findings require supplementary investigation. The results encourage the implementation of MALDI–TOF MS in routine diagnostics and environmental Legionella surveillance, as it displays a reliable and faster identification at the species level, as well as the potential to identify species that are not yet included in the database. Moreover, phylogenetic analysis is a relevant approach to correlate the isolates and to track their spread, especially in unconventional reservoirs, where Legionella prevention is still underestimated.

Download Full-text

Τυποποίηση στελεχών Legionella Pneumophila από περιβαλλοντικά δείγματα και συρροές κρουσμάτων με Matrix assisted laser desortion ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry (ΜALDI-TΟF MS)

10.12681/eadd/46517 ◽

2019 ◽

Author(s):

Μαρία Κυρίτση

Keyword(s):

Mass Spectrometry ◽

Monoclonal Antibodies ◽

Legionella Pneumophila ◽

Time Of Flight ◽

Ionization Time ◽

Maldi Tof Ms ◽

Maldi Tof ◽

Flight Mass Spectrometry ◽

Tof Ms ◽

Matrix Assisted Laser

Η εκτίμηση κινδύνου και η πρόληψη της Νόσου των Λεγεωναρίων βασίζονται κυρίως στην ανίχνευση του μικροοργανισμού σε δείγματα νερού. Νόσο στον άνθρωπο προκαλεί κυρίως η Legionella pneumophila οροτύπου 1 (Lp1) και ιδιαίτερα στελέχη τα οποία φέρουν τις περιοχές παθογονικότητας lvh και rtxA. Επομένως, η αξιολόγηση τόσο του ορότυπου όσο και των προαναφερθέντων παραγόντων παθογονικότητας είναι εξαιρετικά σημαντική προκειμένου να υπάρχει ολοκληρωμένη εκτίμηση κινδύνου ενός συστήματος νερού. Σκοπός της διατριβής: 1. Η ανάπτυξη μίας απλής, ταχείας, φθηνής και αξιόπιστης μεθοδολογίας για τον προσδιορισμό των οροτύπων στελεχών Lp, η οποία να μπορεί να εφαρμοστεί ως μέθοδος ρουτίνας σε ένα μικροβιολογικό εργαστήριο.2. Ο προσδιορισμός αξιόπιστων βιοδεικτών με σκοπό την ανίχνευση των περιοχών παθογονικότητας lvh και rtxA σε στελέχη τα οποία απομονώνονται κατά τη διάρκεια τακτικών ελέγχων. 3. Η επικύρωση των ανωτέρω μεθόδων. Υλικά και μέθοδοι: Για τη διατριβή χρησιμοποιήθηκαν 15 στελέχη αναφοράς και 150 περιβαλλοντικά στελέχη Lp (70 Lp1 και 80 Lp2-15 στελέχη). Οκτώ (8) Lp2-15 στελέχη οροτυπήθηκαν με τη χρήση μονοκλωνικών αντισωμάτων (monoclonal antibodies-Mab), ενώ τα υπόλοιπα περιβαλλοντικά στελέχη οροτυπήθηκαν με τη χρήση δοκιμασίας ανοσοσυγκόλησης. Σε όλα τα στελέχη πραγματοποιήθηκε PCR προς ανίχνευση των περιοχών lvh και rtxA. Κατόπιν, δημιουργήθηκαν ομάδες στελεχών αναφοράς και στελεχών επικύρωσης. Όλα τα στελέχη υποβλήθηκαν σε εξαγωγή των ριβοσωμικών και επιφανειακών πρωτεϊνών και ακολούθησε ανάλυση με MALDI-TOF MS. Στα πρωτογενή φάσματα των στελεχών των ομάδων αναφοράς έγινε επεξεργασία με το λογισμικό Mass-Up για την ανάδειξη βιοδεικτών τόσο για τον προσδιορισμό του οροτύπου όσο και για την ανίχνευση των περιοχών παθογονικότητας. Ακολούθησε επικύρωση της μεθόδου με τη χρήση των στελεχών των ομάδων επικύρωσης.Αποτελέσματα: Για τον προσδιορισμό του οροτύπου η ανάλυση με το λογισμικό Mass-up υπέδειξε πέντε (5) πρωτεϊνικές κορυφές ως πιθανούς βιοδείκτες για τον ορότυπο. Ο αλγόριθμος ταξινόμησε ορθά 115 από τα 132 στελέχη της ομάδας επικύρωσης με ακρίβεια 87,12% (95%CI:80,18-92,32%). Η ευαισθησία της μεθόδου προσδιορίστηκε στο 87,5% (95%CI:77.59-94.12%) και η ειδικότητα στο 86,67% (95%CI:75,41-94,06%). Σχετικά με την ανίχνευση των περιοχών παθογονικότητας προσδιορίστηκαν δύο πρωτεϊνικές κορυφές που μπορούν να χρησιμεύσουν ως βιοδείκτες για την rtxA περιοχή και μία για την lvh. Σε ό,τι αφορά την ανίχνευση της lvh περιοχής, με τη χρήση των βιοδεικτών, ταξινομήθηκαν ορθά τα 113 από τα 137 θετικά και όλα τα αρνητικά στελέχη (14 συνολικά). Η μέθοδος επέδειξε ευαισθησία 82,48% (95%CI:75,06-88,44%), ειδικότητα 100,00% (95%CI:76,84-100,00%) και ακρίβεια 84,11% (95%CI:77,28-89,54%). Ομοίως, για την rtxA περιοχή, 134 από τα 134 θετικά στελέχη και 14 από τα 17 αρνητικά στελέχη ταξινομήθηκαν ορθά. Η μέθοδος παρουσίασε ευαισθησία 100,00% (95%CI:97,28-100,00%), ειδικότητα 76,47% (95%CI:50,10-93,19%) και ακρίβεια 97,35% (95%CI:93,36-99,27%). Συμπεράσματα: Η μέθοδος MALDI-TOF MS, με τη χρήση του πρωτοκόλλου της πρωτεϊνικής εξαγωγής, αποδείχθηκε αξιόπιστη τόσο στον προσδιορισμό του οροτύπου της Lp όσο και στην ανίχνευση των περιοχών παθογονικότητας lvh και rtxA. Αυτοματοποίηση της μεθόδου και περαιτέρω αξιολόγηση με τη χρήση της τεχνικής της απευθείας επίστρωσης του μικροοργανισμού, ώστε να απλοποιηθεί ακόμη περισσότερο το πρωτόκολλο, θα μπορούσε να συνεισφέρει σε μεγαλύτερο βαθμό στην ταχεία, φθηνή και απλή αξιολόγηση κινδύνου, καθώς και στη διερεύνηση κρουσμάτων της Νόσου των Λεγεωναρίων.

Download Full-text