Identification and characterization of native proteins of Escherichia coli BL-21 that display affinity towards Immobilized Metal Affinity Chromatography and Hydrophobic Interaction Chromatography Matrices

2010 ◽  
Vol 70 (2) ◽  
pp. 191-195 ◽  
Author(s):  
Neha Tiwari ◽  
Lauren Woods ◽  
Ryan Haley ◽  
Alicia Kight ◽  
Robyn Goforth ◽  
...  
Keyword(s):  
Escherichia Coli ◽  
Affinity Chromatography ◽  
Hydrophobic Interaction ◽  
Hydrophobic Interaction Chromatography ◽  
Immobilized Metal Affinity Chromatography ◽  
Metal Affinity ◽  
Native Proteins ◽  
Identification And Characterization

OPTIMIZACIÓN DE LA EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DE UNA β-CAROTENO 15,15’-MONOOXIGENASA RECOMBINANTE A PARTIR DE CUERPOS DE INCLUSIÓN

Agrociencia ◽  
2021 ◽  
Vol 55 (4) ◽  
pp. 317-329
Author(s):  
Martín Barbosa Amezcua ◽  
Luz Vázquez Moreno ◽  
Laura González Dávalos ◽  
Armando Shimada ◽  
Ofelia Mora
Keyword(s):  
Escherichia Coli ◽  
Liquid Chromatography ◽  
Affinity Chromatography ◽  
Gallus Gallus ◽  
Fast Protein Liquid Chromatography ◽  
Immobilized Metal Affinity Chromatography ◽  
Gen Y ◽  
Metal Affinity ◽  
High Polarity

Los forrajes utilizados en la producción de ganado bovino en el trópico tienen altos niveles de β-caroteno, que produce canales con grasa de color amarillo y demerita su valor económico. La pigmentación amarilla se debe a la actividad baja de la enzima β -caroteno 15,15’-monooxigenasa (BCMO1) en el intestino delgado e hígado. Un uso biotecnológico de esta enzima podría escindir al β -caroteno en dos moléculas de retinal, eliminar la fuente de coloración y optimizar el valor comercial de la carne del ganado bovino alimentado en pastoreo. El objetivo de este estudio fue obtener una enzima BCMO1 recombinante con actividad similar a las enzimas nativas, a partir de bacterias transformadas con el gen que codifica la b-caroteno 15,15’-monooxigenasa de Gallus gallus (gBCMO1). La enzima se obtuvo por sobre expresión a partir de una Escherichia coli XL1-Blue transformada con dicho gen, y se purificó por Cromatografía rápida de proteína líquida (Fast Protein Liquid Chromatography, FPLC); se midió la actividad in vitro del proceso por Cromatografía de afinidad por metales inmovilizados (Immobilized Metal Affinity Chromatography, IMAC) y el producto final se detectó por Cromatografía de líquidos de polaridad alta (High Polarity Liquid Chromatography, HPLC). Una proteína de aproximadamente 63 kDa se obtuvo, la cual presentó una actividad enzimática de 2993 (± 108.2) pmol mg-1 de proteína h-1 (n=3). La proteína aislada se puede evaluar como aditivo en estudios in vitro con el fin de disminuir la coloración amarilla de las canales de bovinos.

scholarly journals Engineering Escherichia coli BL21(DE3) Derivative Strains To Minimize E. coli Protein Contamination after Purification by Immobilized Metal Affinity Chromatography

2011 ◽  
Vol 77 (13) ◽  
pp. 4634-4646 ◽  
Author(s):  
Carine Robichon ◽  
Jianying Luo ◽  
Thomas B. Causey ◽  
Jack S. Benner ◽  
James C. Samuelson
Keyword(s):  
Escherichia Coli ◽  
Affinity Chromatography ◽  
Metal Binding ◽  
Divalent Cations ◽  
Immobilized Metal Affinity Chromatography ◽  
Content Type ◽  
Cobalt Ions ◽  
Chitin Binding Domain ◽  
E Coli ◽  
Metal Affinity

ABSTRACTRecombinant His-tagged proteins expressed inEscherichia coliand purified by immobilized metal affinity chromatography (IMAC) are commonly coeluted with nativeE. coliproteins, especially if the recombinant protein is expressed at a low level. TheE. colicontaminants display high affinity to divalent nickel or cobalt ions, mainly due to the presence of clustered histidine residues or biologically relevant metal binding sites. To improve the final purity of expressed His-tagged protein, we engineeredE. coliBL21(DE3) expression strains in which the most recurring contaminants are either expressed with an alternative tag or mutated to decrease their affinity to divalent cations. The current study presents the design, engineering, and characterization of twoE. coliBL21(DE3) derivatives, NiCo21(DE3) and NiCo22(DE3), which express the endogenous proteins SlyD, Can, ArnA, and (optionally) AceE fused at their C terminus to a chitin binding domain (CBD) and the protein GlmS, with six surface histidines replaced by alanines. We show that eachE. coliCBD-tagged protein remains active and can be efficiently eliminated from an IMAC elution fraction using a chitin column flowthrough step, while the modification of GlmS results in loss of affinity for nickel-containing resin. The “NiCo” strains uniquely complement existing methods for improving the purity of recombinant His-tagged protein.

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