Οι ψευδομονάδες είναι αζυμωτικά Gram αρνητικά βακτηρίδια, αυστηρά αερόβια και οξειδάση θετικά. Η Pseudomonas aeruginosa αποτελεί κυρίως αίτιο σοβαρών και ποικίλων νοσοκομειακών λοιμώξεων αλλά και λοιμώξεων της κοινότητας, οι οποίες συνήθως είναι ηπιότερες. Την τελευταία δεκαετία έχει παρατηρηθεί μεγάλη αύξηση των ανθεκτικών στις καρβαπενέμες στελεχών Pseudomonas aeruginosa, γεγονός που αποτελεί σημαντικό πρόβλημα στην αντιμετώπιση αυτών των λοιμώξεων, καθώς οι θεραπευτικές επιλογές που απομένουν είναι ελάχιστες. Ο κυριότερος μηχανισμός αντοχής είναι η παραγωγή καρβαπενεμασών, ενζύμων δηλαδή που υδρολύουν τις καρβαπενέμες.Σκοπός της εργασίας μας ήταν α) η φαινοτυπική και μοριακή ανίχνευση των μεταλλο-β-λακταμασών ως επίκτητου μηχανισμού αντοχής στις καρβαπενέμες πολυανθεκτικών στελεχών P. aeruginosa β) η μελέτη του γενετικού περιβάλλοντος των γονιδίων που κωδικοποιούν καρβαπενεμάση και ο χαρακτηρισμός των ιντεγκρονίων, γ) η μοριακή τυποποίηση των στελεχών αυτών και δ) η μελέτη της παθογονικότητας των επικρατούντων κλώνων.Για το λόγο αυτό μελετήσαμε 387 στελέχη από το Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο της Λάρισας και από το Νοσοκομείο «Η Σωτηρία» της Αθήνας από τα οποία τα 126 βρέθηκαν θετικά στην παραγωγή καρβαπενεμάσης τόσο φαινοτυπικά όσο και μοριακά. Συγκεκριμένα, έγινε φαινοτυπική ανίχνευση της παραγωγής καρβαπενεμασών με διάφορες μεθόδους όπως και προσδιορισμός των γονιδίων που είναι υπεύθυνα για την παραγωγή τους με μοριακές μεθόδους, ενώ παράλληλα μελετήθηκε και το γενετικό τους περιβάλλον. Ακολούθησε τυποποίηση των εν λόγω στελεχών με MLST και σύγκριση των κλώνων στα δύο νοσοκομεία. Επιπλέον, μελετήθηκε η παθογονικότητα των επικρατέστερων κλώνων, με πειράματα in vivo. Κατά το χρονικό διάστημα από τον Μάρτιο έως και τον Οκτώβριο του 2011 απομονώθηκαν συνολικά 813 στελέχη Pseudomonas aeruginosa εκ των οποίων 387 (47,6%) παρουσίασαν αντοχή στις καρβαπενέμες (MIC>8μg/ml) σύμφωνα με τα κριτήρια του CLSI, 2012. Από τα 387 ανθεκτικά στις καρβαπενέμες στελέχη, 126 (32,5%) βρέθηκαν θετικά με τις διάφορες φαινοτυπικές δοκιμασίες δηλώνοντας την παρουσία μέταλλο-β-λακταμάσης (τάξης Β) ενώ ανιχνεύτηκαν διάφορα αλληλόμορφα γονίδια της καρβαπενεμάσης VIM. Η ανάλυση της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας του γονιδίου blaVIM, που ακολούθησε, κατέδειξε ότι από τα 126 στελέχη, τα 80 έφεραν το αλληλόμορφο blaVIM-2, τα 36 το αλληλόμορφο blaVIM-4, τα 9 το αλληλόμορφο blaVIM-1και σε 1 στέλεχος το αλληλόμορφο blaVIM-17.Σε όλα τα στελέχη το γονίδιο blaVIM βρέθηκε να αποτελεί τμήμα της γονιδιακής συστοιχίας ιντεγκρονίων τάξης 1, γενετικών δομών που έχουν συσχετιστεί με την εμφάνιση πολυανθεκτικού φαινοτύπου, καθώς είναι ικανές να συσσωρεύουν γονίδια ανθεκτικότητας έναντι διαφόρων τάξεων αντιβιοτικών. Στη συνέχεια η τυποποίηση των ανθεκτικών στις καρβαπενέμες στελεχών P. aeruginosa που διενεργήθηκε με τη μέθοδο MLST, ανέδειξε ότι τα στελέχη P. aeruginosa άνηκαν σε 9 διαφορετικούς STs τύπους και συγκεκριμένα στους ST-111, ST-235, ST-244, ST-253, ST-277, ST-308, ST-395, ST-773 και ST-1457.Η μελέτη της παθογονικότητας αντιπροσωπευτικών MLST στελεχών P. aeruginosa πραγματοποιήθηκε στο μη σπονδυλωτό μοντέλο Galleria mellonella. H Galleria mellonella αποτελεί ένα κατάλληλο μη θηλαστικό μοντέλο-ξενιστή για τη μελέτη του ρόλου του Type III Secretion System στη παθογένεση των ψευδομονάδων. Όλα τα στελέχη αναδείχθηκαν θετικά για τα γονίδια exoT και exoY ενώ διαφορές υπήρχαν στα γονίδια exoS και exoU. Τα υπό μελέτη στελέχη εμφάνισαν διαφορές στη παθογονικότητα. Συγκεκριμένα οι κλώνοι ST111 και ST235 οι οποίοι επικρατούν, αναδείχθηκαν οι λιγότερο παθογονικοί με ποσοστό επιβίωσης των προνυμφών μεγαλύτερο του 50% το πρώτο 24ωρο ενώ οι ST277, ST244 και ST773 αναδείχθηκαν οι πιο παθογονικοί με ποσοστό επιβίωσης 0% στις πρώτες 24 ώρες, παρόμοιο με αυτό των πρότυπων στελεχών.Συνοψίζοντας, καταλήγουμε στα παρακάτω συμπεράσματα:1.Το ποσοστό των ανθεκτικών στις καρβαπενέμες στελεχών P. aeruginosa στα ελληνικά νοσοκομεία για το χρονικό διάστημα που εξετάσαμε ήταν πολύ υψηλό (47,6%), ενώ παράλληλα εμφάνιζαν πολυανθεκτικούς φαινοτύπους, περιορίζοντας τις θεραπευτικές επιλογές2.Η ανθεκτικότητα στις καρβαπενέμες των στελεχών P. aeruginosa οφείλεται σε αρκετά μεγάλο ποσοστό (32,5%) στην παρουσία των αλληλομόρφων του γονιδίου VIM (VIM-1, VIM-2, VIM-4 και VIM-17), τα οποία διαπιστώθηκε ότι εδράζονται επί ιντεγκρονίων, γενετικών δομών με ικανότητα ενσωμάτωσης και άλλων γονιδίων που προσδίδουν αντοχή και σε άλλες τάξεις αντιβιοτικών.3.Η πλειονότητα των ανθεκτικών στις καρβαπενέμες στελεχών P. aeruginosa άνηκαν στους ST-111MLST και ST-235MLST4.Αποτελεί επιτακτική ανάγκη η εύρεση μεθόδων για την άμεση ανίχνευση των στελεχών που παράγουν καρβαπενεμάσες έτσι ώστε να εμποδίζεται η διασπορά. Ανάμεσα στις μεθόδους ανίχνευσης, η τροποποιημένη MALDI-TOF MS αποτελεί μία μέθοδο με υψηλή ευαισθησία και ειδικότητα στην ανίχνευση των ψευδομονάδων που παράγουν καρβαπενεμάση ενώ η δοκιμασία Blue-Carba αποτελεί μια φτηνή, γρήγορη και αξιόπιστη μέθοδο για την ανίχνευση των ψευδομονάδων που παράγουν καρβαπενεμάσες, που θα μπορούσε να εφαρμοσθεί σε οποιοδήποτε εργαστήριο χωρίς ιδιαίτερο εξοπλισμό.5.Υπάρχουν διαφορές στην παθογονικότητα των στελεχών που ανήκουν σε διαφορετικούς STs που δε σχετίζονται με την παρουσία συγκεκριμένων γονιδίων παθογονικότητας του εκκριτικού συστήματος τύπου ΙΙΙ. Οι πιο συχνοί MLST τύποι φαίνεται να σχετίζονται με μειωμένη παθογονικότητα εύρημα που πιθανότατα συσχετίζεται με την ικανότητα τους να διασπείρονται και να επικρατούν έναντι των υπολοίπων.
Use of the Galleria mellonella Caterpillar as a Model Host To Study the Role of the Type III Secretion System in Pseudomonas aeruginosa Pathogenesis
