scholarly journals Diphtheria toxin-resistant mutants of Saccharomyces cerevisiae.

1985 ◽  
Vol 5 (12) ◽  
pp. 3357-3360 ◽  
Author(s):  
J Y Chen ◽  
J W Bodley ◽  
D M Livingston
Keyword(s):  
Saccharomyces Cerevisiae ◽  
Diphtheria Toxin ◽  
Elongation Factor ◽  
Selection Procedure ◽  
Prolonged Storage ◽  
Elongation Factor 2 ◽  
Resistant Phenotype ◽  
Complementation Groups ◽  
Mendelian Character

We developed a selection procedure based on the observation that diphtheria toxin kills spheroplasts of Saccharomyces cerevisiae (Murakami et al., Mol. Cell. Biol. 2:588-592, 1982); this procedure yielded mutants resistant to the in vitro action of the toxin. Spheroplasts of mutagenized S. cerevisiae were transformed in the presence of diphtheria toxin, and the transformed survivors were screened in vitro for toxin-resistant elongation factor 2. Thirty-one haploid ADP ribosylation-negative mutants comprising five complementation groups were obtained by this procedure. The mutants grew normally and were stable to prolonged storage. Heterozygous diploids produced by mating wild-type sensitive cells with the mutants revealed that in each case the resistant phenotype was recessive to the sensitive phenotype. Sporulation of these diploids yielded tetrads in which the resistant phenotype segregated as a single Mendelian character. From these observations, we concluded that these mutants are defective in the enzymatic steps responsible for the posttranslational modification of elongation factor 2 which is necessary for recognition by diphtheria toxin.

Diphtheria toxin-resistant mutants of Saccharomyces cerevisiae

1985 ◽  
Vol 5 (12) ◽  
pp. 3357-3360
Author(s):  
J Y Chen ◽  
J W Bodley ◽  
D M Livingston
Keyword(s):  
Saccharomyces Cerevisiae ◽  
Diphtheria Toxin ◽  
Elongation Factor ◽  
Selection Procedure ◽  
Prolonged Storage ◽  
Elongation Factor 2 ◽  
Resistant Phenotype ◽  
Complementation Groups ◽  
Mendelian Character

We developed a selection procedure based on the observation that diphtheria toxin kills spheroplasts of Saccharomyces cerevisiae (Murakami et al., Mol. Cell. Biol. 2:588-592, 1982); this procedure yielded mutants resistant to the in vitro action of the toxin. Spheroplasts of mutagenized S. cerevisiae were transformed in the presence of diphtheria toxin, and the transformed survivors were screened in vitro for toxin-resistant elongation factor 2. Thirty-one haploid ADP ribosylation-negative mutants comprising five complementation groups were obtained by this procedure. The mutants grew normally and were stable to prolonged storage. Heterozygous diploids produced by mating wild-type sensitive cells with the mutants revealed that in each case the resistant phenotype was recessive to the sensitive phenotype. Sporulation of these diploids yielded tetrads in which the resistant phenotype segregated as a single Mendelian character. From these observations, we concluded that these mutants are defective in the enzymatic steps responsible for the posttranslational modification of elongation factor 2 which is necessary for recognition by diphtheria toxin.

In vitro biosynthesis of diphthamide, studied with mutant Chinese hamster ovary cells resistant to diphtheria toxin

1984 ◽  
Vol 4 (4) ◽  
pp. 642-650
Author(s):  
T J Moehring ◽  
D E Danley ◽  
J M Moehring
Keyword(s):  
Chinese Hamster Ovary ◽  
Diphtheria Toxin ◽  
Chinese Hamster Ovary Cells ◽  
Chinese Hamster ◽  
Elongation Factor ◽  
Synthetase Activity ◽  
Post Translational Modification ◽  
Ovary Cells ◽  
Elongation Factor 2

Diphthamide, a unique amino acid, is a post-translational derivative of histidine that exists in protein synthesis elongation factor 2 at the site of diphtheria toxin-catalyzed ADP-ribosylation of elongation factor 2. We investigated steps in the biosynthesis of diphthamide with mutants of Chinese hamster ovary cells that were altered in different steps of this complex post-translational modification. Biochemical evidence indicates that this modification requires a minimum of three steps, two of which we accomplished in vitro. We identified a methyltransferase activity that transfers methyl groups from S-adenosyl methionine to an unmethylated form of diphthine (the deamidated form of diphthamide), and we tentatively identified an ATP-dependent synthetase activity involved in the biosynthesis of diphthamide from diphthine. Our results are in accord with the proposed structure of diphthamide (B. G. VanNess, et al., J. Biol. Chem. 255:10710-10716, 1980).

scholarly journals In vitro biosynthesis of diphthamide, studied with mutant Chinese hamster ovary cells resistant to diphtheria toxin.

1984 ◽  
Vol 4 (4) ◽  
pp. 642-650 ◽  
Author(s):  
T J Moehring ◽  
D E Danley ◽  
J M Moehring
Keyword(s):  
Chinese Hamster Ovary ◽  
Diphtheria Toxin ◽  
Chinese Hamster Ovary Cells ◽  
Chinese Hamster ◽  
Elongation Factor ◽  
Synthetase Activity ◽  
Post Translational Modification ◽  
Ovary Cells ◽  
Elongation Factor 2

Diphthamide, a unique amino acid, is a post-translational derivative of histidine that exists in protein synthesis elongation factor 2 at the site of diphtheria toxin-catalyzed ADP-ribosylation of elongation factor 2. We investigated steps in the biosynthesis of diphthamide with mutants of Chinese hamster ovary cells that were altered in different steps of this complex post-translational modification. Biochemical evidence indicates that this modification requires a minimum of three steps, two of which we accomplished in vitro. We identified a methyltransferase activity that transfers methyl groups from S-adenosyl methionine to an unmethylated form of diphthine (the deamidated form of diphthamide), and we tentatively identified an ATP-dependent synthetase activity involved in the biosynthesis of diphthamide from diphthine. Our results are in accord with the proposed structure of diphthamide (B. G. VanNess, et al., J. Biol. Chem. 255:10710-10716, 1980).

scholarly journals Saccharomyces cerevisiae elongation factor 2. Genetic cloning, characterization of expression, and G-domain modeling.

1992 ◽  
Vol 267 (2) ◽  
pp. 1190-1197 ◽  
Author(s):  
J P Perentesis ◽  
L D Phan ◽  
W B Gleason ◽  
D C LaPorte ◽  
D M Livingston ◽  
...  
Keyword(s):  
Saccharomyces Cerevisiae ◽  
Elongation Factor ◽  
Domain Modeling ◽  
Elongation Factor 2

scholarly journals The Ras/PKA Signaling Pathway May Control RNA Polymerase II Elongation via the Spt4p/Spt5p Complex in Saccharomyces cerevisiae

Genetics ◽  
2003 ◽  
Vol 165 (3) ◽  
pp. 1059-1070
Author(s):  
Susie C Howard ◽  
Arelis Hester ◽  
Paul K Herman
Keyword(s):  
Saccharomyces Cerevisiae ◽  
Cell Growth ◽  
Rna Polymerase ◽  
Rna Polymerase Ii ◽  
Signaling Pathway ◽  
Elongation Factor ◽  
Ras Signaling ◽  
Elongation Step ◽  
Rna Polymerase Ii Transcription

Abstract The Ras signaling pathway in Saccharomyces cerevisiae controls cell growth via the cAMP-dependent protein kinase, PKA. Recent work has indicated that these effects on growth are due, in part, to the regulation of activities associated with the C-terminal domain (CTD) of the largest subunit of RNA polymerase II. However, the precise target of these Ras effects has remained unknown. This study suggests that Ras/PKA activity regulates the elongation step of the RNA polymerase II transcription process. Several lines of evidence indicate that Spt5p in the Spt4p/Spt5p elongation factor is the likely target of this control. First, the growth of spt4 and spt5 mutants was found to be very sensitive to changes in Ras/PKA signaling activity. Second, mutants with elevated levels of Ras activity shared a number of specific phenotypes with spt5 mutants and vice versa. Finally, Spt5p was efficiently phosphorylated by PKA in vitro. Altogether, the data suggest that the Ras/PKA pathway might be directly targeting a component of the elongating polymerase complex and that this regulation is important for the normal control of yeast cell growth. These data point out the interesting possibility that signal transduction pathways might directly influence the elongation step of RNA polymerase II transcription.

scholarly journals Μελέτη μορίων του πρωτόζωου Leishmania που εμπλέκονται στην πρόοδο του κυτταρικού κύκλου

2014 ◽  
Author(s):  
Αλέξανδρος Αλεξανδράτος
Keyword(s):  
Heat Shock ◽  
Elongation Factor ◽  
Alpha Subunit ◽  
Elongation Factor 2 ◽  
Mitochondrial Processing Peptidase ◽  
Eukaryotic Elongation Factor 2 ◽  
Eukaryotic Elongation Factor ◽  
Processing Peptidase

Τα είδη του γένους Leishmania αποτελούν υποχρεωτικά ενδοκυττάρια πρωτοζωικά παράσιτα που προκαλούν ένα ευρύ φάσμα ασθενειών, τις λεισμανιάσεις. Η λεϊσμανίαση θεωρείται νόσος εξέχουσας σπουδαιότητας, με 2 εκατομμύρια νέα κρούσματα το χρόνο, χρήζουσας μεγάλης κοινωνικής και οικονομικής σημασίας. Για τον έλεγχο των συνεχώς αυξανόμενων κρουσμάτων, είναι επιτακτική ανάγκη η ανάπτυξη νέων μη-τοξικών φαρμάκων που θα στοχεύουν σε μόρια-στόχους σημαντικά για την ολοκλήρωση του παρασιτικού κύκλου ζωής. Κατ’ αυτόν τον τρόπο κρίνεται απαραίτητη η μελέτη μηχανισμών και παραγόντων μολυσματικότητας του παρασίτου, που ελέγχουν τον κυτταρικό κύκλο και τη διαφοροποίηση του παρασίτου. Στα πλαίσια αυτά, έχει δειχθεί ότι η επισωμική υπερέκφραση της συνδετικής ιστόνης Η1 του παρασίτου Leishmania (LeishH1) οδηγεί στην καθυστέρηση της ολοκλήρωσης του κυτταρικού κύκλου, αλλά παράλληλα και στη μείωση του ρυθμού διαφοροποίησης των παρασίτων από προμαστιγωτές σε αμαστιγωτές μορφές, έχοντας σαν αποτέλεσμα τη μείωση της μολυσματικότητας του παρασίτου τόσο in vitro όσο και in vivo. Στόχος αυτής της διατριβής ήταν η ανάδειξη μορίων που επηρεάζουν τη μολυσματικότητα του παρασίτου, μελετώντας το προτέωμα των μη μολυσματικών παρασίτων που υπερεκφράζουν την LeishH1. Η συγκριτική μελέτη των παρασίτων που υπερεκφράζουν τη LeishH1 σε σχέση με τα παράσιτα ελέγχου, είχε επίσης ως σκοπό την περαιτέρω μελέτη του βιολογικού ρόλου της LeishH1 στα παράσιτα και τη διερεύνηση του ρόλου της στη γονιδιακή ρύθμιση του παρασίτου. Η συγκριτική πρωτεομική ανάλυση με ηλεκτροφόρηση δυο-διαστάσεων, των παρασίτων που υπερεκφράζουν την LeishH1 σε σχέση με τα παράσιτα ελέγχου, κατέδειξε πως μόνο μια μικρή ομάδα πρωτεϊνών παρουσιάζει διαφορική έκφραση. Συγκεκριμένα, τρεις πρωτεΐνες [heat shock protein 83 (HSP83), eukaryotic elongation factor 2(eEF-2), alpha subunit of the mitochondrial processing peptidase (α-MPP)] παρουσιάζουν χαμηλότερα επίπεδα έκφρασης ενώ άλλες δυο (α/β τουμπουλίνη, ΜΑΡ) παρουσιάζουν μεγαλύτερη κατανομή έκφρασης. Πειράματα αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης αντίστροφης μεταγραφάσης πραγματικού χρόνου, επιβεβαίωσαν το αποτέλεσμα αυτό, υποδηλώνοντας ότι η LeishH1 δεν είναι γενικός καταστολέας της μεταγραφής αλλά επηρεάζει ένα ειδικό υποσύνολο πρωτεϊνών, σε προ- ή μετα-μεταγραφικό επίπεδο. Ανάμεσα στις πρωτεΐνες με διαφορική έκφραση ήταν και η τουμπουλίνη. Η διαφορική έκφραση της πρωτεΐνης αντικατοπτρίζεται άμεσα στη μορφολογία των παρασίτων που υπερεκφράζουν την LeishH1, καθώς τα παράσιτα αυτά παρουσιάζουν μικρότερο και πιο στρογγυλό σχήμα και μεγαλύτερη μορφολογική ετερογένεια. Μια ακόμα πρωτεΐνη με διαφορική έκφραση, ήταν και η HSP83, η οποία παρουσίασε χαμηλότερα επίπεδα. Θέλοντας να εξακριβώσουμε σε ποιο επίπεδο παρεμβαίνει η LeishH1 στο μηχανισμό έκφρασης της HSP83, συγκρίναμε τα επίπεδα του mRNA και η ανάλυση κατέδειξε ότι δεν υπάρχουν διαφορές στα επίπεδα αυτά. Επίσης, μελετήθηκε ο ρυθμός έκφρασης της πρωτεΐνης μέσω της μεταβολικής σήμανσης των πρωτεϊνών και αποκαλύφθηκε πως σε αυτό το στάδιο εντοπίζεται η παρεμβολή της LeishH1, καθώς τα παράσιτα που την υπερεκφράζουν παρουσιάζουν χαμηλότερο ρυθμό έκφρασης της HSP83. Συμπερασματικά διαφαίνεται πως υπάρχει μια συσχέτιση μεταξύ μονοπατιών που εμπλέκονται στην αντίσταση έναντι φαρμακευτικών ουσιών, στην απόπτωση και τη μολυσματικότητα. Κατ’ αυτόν τον τρόπο, τα ειδικά σήματα και οι μηχανισμοί που ρυθμίζουν τη διαφοροποίηση/μολυσματικότητα του παρασίτου και την απόπτωση/απόκριση στο στρες, χρήζουν περαιτέρω διερεύνησης καθώς φαίνεται να αποτελούν τις δυο όψεις του ίδιου νομίσματος.

Sign in / Sign up

Export Citation Format

Share Document