scholarly journals Simplification of RNA preparation procedure for RT-PCR in detection of pome fruit tree viruses

2017 ◽  
Vol 38 (SI 2 - 6th Conf EFPP 2002) ◽  
pp. 252-254 ◽  
Author(s):  
J.K. Kundu
Keyword(s):  
Rna Extraction ◽  
Similar Rate ◽  
Preparation Procedure ◽  
Plant Tissues ◽  
Rt Pcr ◽  
Pome Fruit ◽  
Apple Stem Grooving Virus ◽  
Apple Stem ◽  
Apple Cultivars ◽  
Stem Pitting

A rapid, easy to handling and sensitive RNA preparation procedure, RNA release protocol was described here for the detection of Apple stem pitting virus (ASPV) and Apple stem grooving virus (ASGV) by RT-PCR. Comparing total RNA extraction protocol, RNA release protocol give raised similar rate of ASPV and ASGV detection within the field-grown apple cultivars. Among sampling plant tissues, the bud leaf and leaf (during blossom) were showed efficient tissues for the routine detection, regardless the using RNA preparation procedures.

scholarly journals The application of RT-PCR assay for the detection of Apple stem pitting virus and Apple stem grooving virus in four apple cultivars

2012 ◽  
Vol 38 (No. 1) ◽  
pp. 13-17 ◽  
Author(s):  
J.K. Kundu
Keyword(s):  
Mixed Infection ◽  
Rt Pcr ◽  
Pome Fruit ◽  
Chain Reaction ◽  
Pcr Assay ◽  
Apple Stem Grooving Virus ◽  
Apple Stem ◽  
Apple Cultivars ◽  
Apple Stem Pitting Virus ◽  
Stem Pitting

The reverse transcription polymerace chain reaction (RT-PCR) assay was successfully used for the detection of Apple stem pitting virus (ASPV) and Apple stem grooving virus (ASGV) in four apple cultivars of a 25 years old orchard. These two main pome fruit viruses were detected frequently in all tested apple cultivars. ASGV and ASPV occurred in as many as 16 trees (in the cultivar Spartan) and 13 trees (in the cultivar Idared) out of 20 tested trees, respectively. Mixed infection by ASGV and ASPV was found in all tested cultivars (as many as 9 out of 20 tested trees of the cultivar Spartan).

scholarly journals Development and validation of protocols for virus, viroid and phytoplasma detection to be used for the certification of pome fruit propagation material

2021 ◽  
Author(s):  
Ιωάννα Μαλανδράκη
Keyword(s):  
Minor Groove Binder ◽  
Rt Pcr ◽  
Pome Fruit ◽  
Dna Minor Groove ◽  
Apple Stem Grooving Virus ◽  
Apple Stem ◽  
Development And Validation ◽  
Stem Pitting ◽  
Propagation Material ◽  
Scar Skin

Ήδη από τη δεκαετία του 60 η έρευνα για τις ιώσεις και τις συναφείς με αυτές ασθένειες των γιγαρτόκαρπων είχε αρχίσει να συστηματοποιείται καθώς γίνονταν αντιληπτές οι σημαντικές οικονομικές απώλειες που προκαλούν. Τα γιγαρτόκαρπα πολλαπλασιάζονται με εμβολιασμό της επιθυμητής ποικιλίας σε κατάλληλο υποκείμενο. Καθώς οι ιοί, τα ιοειδή και τα φυτοπλάσματα που τα προσβάλλουν είναι εμβολιο-μεταδιδόμενα, διασπείρονται και μεταφέρονται ακούσια με το πολλαπλασιαστικό υλικό. Μέχρι σήμερα δεν υπάρχουν επίσημα διαγνωστικά πρωτόκολλα για τα περισσότερα από αυτά τα παθογόνα ενώ παράλληλα, με την ολοένα και ευρύτερη εφαρμογή της αλληλούχησης υψηλής απόδοσης (High-Throughput Seguencing, HTS), ανακαλύπτονται διαρκώς νέοι ιοί και ιοειδή που πιθανόν να σχετίζονται με ασθένειες των γιγαρτόκαρπων. Στόχος της παρούσης εργασίας ήταν αρχικά να αναπτυχθούν διαγνωστικά πρωτόκολλα, βασισμένα σε σύγχρονες μοριακές τεχνικές, για τους πιο κοινούς ιούς, ιοειδή και φυτοπλάσματα που προσβάλλουν τα γιγαρτόκαρπα, ώστε να εφαρμοστούν κατά τον έλεγχο του πολλαπλασιαστικού υλικού. Παράλληλα, στόχος ήταν η εν μέρει επικαιροποίηση των δεδομένων για τη διασπορά και τη συχνότητα εμφάνισης των γνωστών ιών και ιοειδών που απαντώνται στις καλλιέργειες γιγαρτόκαρπων της Ελλάδας αλλά και η μελέτη της γενετικής ποικιλομορφίας τους. Τέλος, επιδιώχθηκε η διαπίστωση της ύπαρξης τυχόν νέων ιών και ιοειδών των γιγαρτόκαρπων στην Ελλάδα και η ανάπτυξη μεθόδων ανίχνευσής τους. Για την πραγματοποίηση των στόχων της εργασίας, έγινε σχεδιασμός δύο δοκιμών, αντίστροφης μεταγραφής-ποσοτικής αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυμεράσης (RT-qPCR) με ιχνηλάτες για την ταυτόχρονη ανίχνευση τριών στόχων σε ένα δείγμα με μία αντίδραση. H πρώτη δοκιμή αναπτύχθηκε για την ταυτόχρονη ανίχνευση των ιών της βοθρίωσης του ξύλου της μηλιάς (apple stem pitting virus), του αυλακωτού ξύλου της μηλιάς (apple stem grooving virus) και του μωσαϊκού της μηλιάς (apple mosaic virus), και η δεύτερη για τα ιοειδή της εσχάρωσης του φλοιού των μήλων (apple scar skin viroid), του εξανθηματικού έλκους της αχλαδιάς (pear blister canker viroid) και καθολικά των φυτοπλάσματων. Λόγω της υψηλής γενετικής παραλλακτικότητας, σχεδιάστηκαν μικρότερου μήκους ιχνηλάτες στους οποίους συζεύχθηκαν μόρια που προσδένονται στην ελάσσονα αύλακα του DNA (minor groove binder, MGB) και τα οποία προσδίδουν τη δυνατότητα αποτελεσματικού και εξειδικευμένου υβριδισμού του ιχνηλάτη στο στόχο σε υψηλές θερμοκρασίες. Οι μέθοδοι συνδυάστηκαν με πρωτόκολλα εξαγωγής ολικών νουκλεϊκών οξέων βασιζόμενα στην τασιενεργό ουσία CTAB, ακολούθησε βελτιστοποίηση των συνθηκών των αντιδράσεων για πολλαπλή, ταυτόχρονη ενίσχυση των στόχων καθώς και δοκιμές για την ευαισθησία, εξειδίκευση και επαναληψιμότητά τους. Τέλος, προσδιορίστηκαν τα όρια ανίχνευσης και έγινε σύγκριση με συμβατικές μεθόδους, η οποία έδειξε 10-100 φορές μεγαλύτερη ευαισθησία των νέων δοκιμών. Και τα δύο πρωτόκολλα παρουσίασαν υψηλή ευαισθησία, αποτελεσματικότητα και αξιοπιστία στην ανίχνευση των κυριότερων ιών και συναφών παθογόνων των γιγαρτοκάρπων, είτε αυτά διέθεταν RNA είτε DNA γονιδίωμα. Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε επισκόπηση καλλιεργειών μηλιάς σε τρεις διαφορετικές γεωγραφικές περιοχές της Ελλάδας – στην Τεγέα, η οποία ανήκει στην περιφερειακή ενότητα Αρκαδίας στην Πελοπόννησο, και στην Αγιά και τη Ζαγορά της περιφέρειας Θεσσαλίας– για συλλογή δειγμάτων με συμπτώματα ιώσεων ή και ασυμπτωματικών. Τα δείγματα ελέγχθηκαν με τα νέα πρωτόκολλα και η αυξημένη ευαισθησία τους συνέβαλε στην επικαιροποίηση των δεδομένων από προηγούμενες έρευνες για τη συχνότητα εμφάνισης και διάδοσης του κάθε ιού στην Ελλάδα. Επιλεγμένα δείγματα αναλύθηκαν κατά ομάδες με εφαρμογή της HTS. Από την βιοπληροφορική ανάλυση των δεδομένων, προέκυψαν για πρώτη φορά σχεδόν πλήρεις αλληλουχίες του γονιδιώματος ελληνικών απομονώσεων των κυριότερων ιών οι οποίες επιβεβαίωσαν και in silico την αποτελεσματικότητα των ολιγονουκλεοτιδίων που σχεδιάστηκαν ενώ πραγματοποιήθηκαν και φυλογενετικές αναλύσεις. Επίσης, διαπιστώθηκε για πρώτη φορά στην Ελλάδα η παρουσία τεσσάρων πρόσφατα ανακαλυφθέντων ιών και ενός ιοειδούς στις μηλιές (apple rubbery wood virus 1 και 2, citrus concave gum-associated virus, apple luteovirus 1, apple hammerhead viroid) αλλά και ενός πιθανολογούμενου νέου ιού του γένους Cytorhabdovirus. Για την επιβεβαίωση των αποτελεσμάτων της HTS, αναπτύχθηκαν συμβατικές RT-PCR και ακολούθησε αλληλούχηση Sanger. Ο έλεγχος όλων των δειγμάτων για αυτά τα παθογόνα έδωσε μια ενδεικτική πρώτη εκτίμηση της διασποράς τους στους οπωρώνες. Το ιολογικό φορτίο (ίωμα) της μηλιάς στις τρεις διαφορετικές περιοχές της Ελλάδας παρουσίασε διαφορές ως προς τον πλούτο της σύνθεσής του οι οποίες αντικατοπτρίζουν τη χρήση ή όχι πιστοποιημένου πολλαπλασιαστικού υλικού και την ηλικία των οπωρώνων της κάθε περιοχής. Η παρούσα διδακτορική διατριβή παρουσιάζει μία πρώτη λεπτομερή καταγραφή του ιώματος της μηλιάς στην Ελλάδα και προσφέρει ένα περιεκτικό σύνολο διαγνωστικών πρωτοκόλλων για την ανίχνευση των σημαντικότερων γνωστών αλλά και των προσφάτως ανακαλυφθέντων ιών, ιοειδών και φυτοπλασμάτων των γιγαρτόκαρπων, τα οποία μπορούν να χρησιμοποιηθούν στον έλεγχο και την πιστοποίηση του πολλαπλασιαστικού υλικού γιγαρτόκαρπων με στόχο έναν υγιέστερο και βιώσιμο οπωρώνα.

scholarly journals The occurrence of Apple stem pitting virus and Apple stem grooving virus within field-grown apple cultivars evaluated by RT-PCR

2011 ◽  
Vol 39 (No. 3) ◽  
pp. 88-92 ◽  
Author(s):  
J.K. Kundu
Keyword(s):  
Polymerase Chain Reaction ◽  
Mixed Infection ◽  
Rt Pcr ◽  
Chain Reaction ◽  
Apple Stem Grooving Virus ◽  
Apple Stem ◽  
Apple Cultivars ◽  
Polymerase Chain ◽  
Apple Stem Pitting Virus ◽  
Stem Pitting

The reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) was successfully used to determine the occurrence of Apple stem pitting virus (ASPV) and Apple stem grooving virus (ASGV) in field-grown apple cultivars. Both viruses were detected frequently in all 16 tested apple cultivars. As many as 27.86% ASPV-infected and 44% ASGV-infected trees were recorded among a total of 420 tested trees from 15 different orchards. Mixed infection with ASGV and ASPV was recorded in 16.7% of the trees.  

scholarly journals Establishment of Nuclear Stock Collections for Apple and Pear in Latvia

2017 ◽  
Vol 71 (3) ◽  
pp. 156-165
Author(s):  
Neda Zuļģe ◽  
Anna Kāle ◽  
Alina Gospodaryk ◽  
Kristīne Vēvere ◽  
Inga Moročko-Bičevska
Keyword(s):  
Climatic Conditions ◽  
Rt Pcr ◽  
Pome Fruit ◽  
Fruit Species ◽  
Planting Material ◽  
Apple Stem ◽  
Heat Treated ◽  
Pome Fruits ◽  
Chlorotic Leaf ◽  
Apple Cultivars

AbstractApples and pears are among the most important commercial fruit species grown in Latvia. Because of suitability to local climatic conditions, mainly domestic cultivars and cultivars originating in neighbouring countries are grown. The planting material of pome fruits produced and used for establishment of new orchards in Latvia corresponds to the Conformitas Agraria Communitatis standard due to the unavailability of nuclear stock. To establish virus-tested, experimental nuclear stock for apple and pear, one to two years old candidate plants were exposed to thermotherapy at +38 °C for 40 to 70 days. The mother trees and candidate plants before treatment were tested for the presence of the four most widespread pome fruit viruses by RT-PCR. The shoot tips of the heat-treated plants were grafted onto seedling rootstocks and were re-tested for the four viruses by RT-PCR during the next three to five vegetation seasons. Several plants of apple cultivars ‘Dace’, ‘Zarja Alatau’, ‘Rubin’, and ‘Ausma’ remained infected either with Apple chlorotic leaf spot virus, Apple stem growing virus or Apple stem pitting virus after the thermotherapy. Tests on woody indicators were carried out to determine possible presence of graft-transmittable organisms according to EPPO guidelines for the establishment of nuclear stock material for pome fruits.

Optimization of tissue and time for rapid serological and molecular detection of Apple stem pitting virus and Apple stem grooving virus in apple’

2018 ◽  
Vol 46 (5) ◽  
pp. 705-713 ◽  
Author(s):  
Sajad Un Nabi ◽  
Javid Iqbal Mir ◽  
Om Chand Sharma ◽  
Desh Beer Singh ◽  
Shafia Zaffer ◽  
...  
Keyword(s):  
Molecular Detection ◽  
Apple Stem Grooving Virus ◽  
Apple Stem ◽  
Apple Stem Pitting Virus ◽  
Stem Pitting

scholarly journals Results of in vitro chemotherapy of apple cv. Fragrance – Short communication

2013 ◽  
Vol 40 (No. 4.) ◽  
pp. 186-190 ◽  
Author(s):  
F. Parštein ◽  
J. Sedlák ◽  
L. Svobodová ◽  
J. Polák ◽  
S. Gadiou
Keyword(s):  
Repeated Treatment ◽  
Pome Fruit ◽  
Initial Field ◽  
In Vitro Plants ◽  
Apple Stem ◽  
In Vitro Shoots ◽  
Chlorotic Leaf ◽  
Stem Pitting ◽  
In Vitro Chemotherapy

The effect of the chemotherapy with ribavirin on the elimination of the pome fruit viruses from in vitro grown plants of infected apple cv. Fragnance has been investigated. The results of ELISA and RT-PCR testing proved the presence of mixed infection of Apple stem pitting virus (ASPV), Apple chlorotic leaf spot virus (ACLSV) and Apple stem grooving virus (ASGV) in the initial field-grown tree of this apple cultivar. Obtained actively growing in vitro shoots with well-developed leaves and shoot tips were subsequently used for chemotherapy with ribavirin. Attempts to fully eliminate viruses by ribavirin in lower concentration 20 mg/l were not successful. However in vitro plants of one mericlone (FR1R20) sanitated from ASPV and ASGV, which were infected with ACLSV only after the first chemotherapy cycle, were subjected to repeated treatment on medium with higher ribavirin concentration 100 mg/l. The success of chemotherapy with ribavirin at 100 mg/l was 76% for ACLSV elimination after the second round. In the course of both chemotherapy cycles (20 mg/l and 100 mg/l), in vitro plants did not display symptoms of phytotoxicity.

scholarly journals Detection of Apple Stem Grooving Virus in Dormant Apple Trees with Crude Extracts as Templates for One-Step RT-PCR

Plant Disease ◽  
1998 ◽  
Vol 82 (7) ◽  
pp. 785-790 ◽  
Author(s):  
Vera L. A. Marinho ◽  
J. Kummert ◽  
G. Rufflard ◽  
D. Colinet ◽  
P. Lepoivre
Keyword(s):  
Rt Pcr ◽  
Degenerate Primers ◽  
Apple Trees ◽  
Active Growth ◽  
Japanese Strain ◽  
Apple Stem Grooving Virus ◽  
Apple Stem ◽  
Crude Extracts ◽  
One Step ◽  
The One

Partial nucleotide sequences of amplification products obtained from four European apple stem grooving virus (ASGV) isolates using degenerate primers showed 80 to 85% similarity with the published ASGV sequence of a Japanese strain but 98 to 100% identities among themselves. Based on these sequences, two ASGV-specific primers (ASGV4F-ASGV4R) were designed to amplify a 574-bp fragment located in the putative viral RNA polymerase. With these primers, six European and five American ASGV isolates, maintained in herbaceous hosts (Chenopodium quinoa, Nicotiana glutinosa, and N. occidentalis) or in apple trees, were readily detected by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR). Using these specific ASGV primers, dsRNA preparations have been shown to constitute good templates for reliable amplification of ASGV sequences from leaves and bark tissues of apple trees, both in a two-step RT-PCR protocol and in the one-step Titan One-Tube RT-PCR. System. Furthermore, the one-step RT-PCR system allowed a specific amplification of ASGV sequences directly from clarified crude extracts of leaves and bark tissues of apple trees during both active growth and the dormant season.

scholarly journals Improved RNA Extraction from Woody Plants for the Detection of Viral Pathogens by Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction

Plant Disease ◽  
1997 ◽  
Vol 81 (2) ◽  
pp. 222-226 ◽  
Author(s):  
Donald J. MacKenzie ◽  
Morven A. McLean ◽  
Srima Mukerji ◽  
Margaret Green
Keyword(s):  
Polymerase Chain Reaction ◽  
Reverse Transcription ◽  
Woody Plants ◽  
Rna Extraction ◽  
Viral Rna ◽  
Rt Pcr ◽  
Chain Reaction ◽  
Apple Stem ◽  
Spin Column ◽  
Polymerase Chain

An efficient procedure for the extraction of high-quality RNA from woody plants without the use of phenol, organic solvents, or alcohol precipitation is described. The method employs commercially available spin-column matrices and mitigates the inhibitory effects of plant polysaccharides and polyphenolic compounds commonly observed on subsequent polymerase chain reaction amplification when conventional extraction methods are applied to woody plant species. The method described has been successfully used in the development of highly sensitive reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) techniques for the detection of a number of viruses in their woody hosts. The viruses detected included apple stem grooving capillovirus (ASGV), apple stem pitting virus, Prunus necrotic ringspot ilarvirus (PNRSV), grapevine fanleaf and Arabis mosaic nepoviruses, and grapevine leafroll-associated closterovirus type 3. The method described was equally effective for the extraction of viral RNA from either budwood, leaves, or flower blossoms as determined by the equivalent RT-PCR detection of ASGV and PNRSV from these tissues. Detection of viral RNA in samples of total plant RNA prepared using this method was found to be as sensitive as was previously described for the immunocapture RT-PCR technique.

Sign in / Sign up

Export Citation Format

Share Document