Kloning cDNA lengkap penyandi ACCase subunit biotin carboxylase dari mesokarp kelapa sawit (Elaeis guineensis Jacq.) Cloning of full length cDNA encoding ACCase subunit biotin carboxylase from mesocarp of oil palm (Elaeis guineensis Jacq.)

AbstractAcetyl-CoA Carboxylase (ACCase) is considered to beone of the key enzymes in palm oil biosynthesis. Availabilityof genes encoding this enzyme would give some advantagesin the molecular breeding of oil palm. Over expression ofthe genes in the oil palm mesocarp might increase the oilproduction in this tissue. On the other hand, downregulating of ACCase could divert the central metaboliteAcetyl-CoA to other product such as PHB (Polyhydroxy-butyrate), one of the known biodegradable plastic. Thispaper reported the work of cloning of the full length codingsequence of biotin carboxylase (BC), one subunit of theACCase. Based on the DNA sequence of the BC conservedregion that had cloned previously, primers pairs weredesigned to amplify 5’- and 3’- cDNA ends of BC usingRACE-PCR. The RACE products of 5’- and 3’- cDNA endsof BC were cloned into E.coli, and the DNAs weresequenced and analysed. The full cDNA of BC was obtainedby reisolation of the cloned 5’- and 3’- cDNA ends followedby digestion using KpnI, ligation into pGEM-T vector andcloning into E.coli. Colony PCR was carried out to confirmthat the target gene has been cloned. The recombinantplasmid containing full cDNA of BC was then isolated forDNA sequencing. The results showed that the 5’-BC (1367bp), 3’- BC (1032 bp), and the full length cDNA encodingBC (2182 bp) had been successfully cloned, and the DNAsequence had been confirmed as gene encoding ACCasesubunit biotin carboxylase.AbstrakAcetyl-CoA Carboxylase (ACCase) merupakan salahsatu enzim kunci dalam biosintesis minyak sawit. Keter-sediaan gen penyandi enzim ini sangat berguna dalampemuliaan kelapa sawit secara molekuler. Over-ekspresi genpenyandi ACCase pada mesokarp dapat meningkatkan pro-duksi minyak pada jaringan tersebut. Sebaliknya ekspresiACCase dapat ditekan melalui mekanisme down regulation sehingga metabolit central Acetyl-CoA dapat diarahkanuntuk menghasilkan produk lain seperti PHB (polyhydro-xybutyrate), salah satu jenis biodegradable plastik yangtelah banyak dikenal. Penelitian ini bertujuan untukmengklon cDNA lengkap penyandi ACCase subunit biotincarboxylase (BC) dari mesokarp kelapa sawit. Berdasarkansekuen DNA daerah konservatif BC yang telah diklon darimesokarp kelapa sawit pada penelitian sebelumnya, duapasang primer dirancang untuk mengamplifikasi daerahujung 5’- dan 3’- cDNA BC dengan RACE-PCR. Produk5’-RACE dan 3’-RACE diklon dan disekuen. cDNAlengkap penyandi BC diperoleh dengan jalan mengisolasikembali fragmen 5’- dan 3’- cDNA terklon, dilanjutkandengan digesti menggunakan enzim restriksi KpnI, ligasikedua fragmen ke vektor kloning pGEM-T, dan introduksike dalam E. coli. Setelah dilakukan PCR koloni untukmenguji keberhasilan kloning, plasmid rekombinan yangmengandung cDNA lengkap dari BC diisolasi untuk analisissekuen DNA. Dari penelitian ini fragmen cDNA 5’-BC(1367 pb) dan 3’- BC (1032 pb), serta cDNA lengkappenyandi BC berukuran 2182 pb telah diperoleh dan diklondalam E. coli. Analisis sekuen DNA mengkonfirmasi bahwacDNA terklon adalah benar gen penyandi ACCase subunitbiotin carboxylase.

Download Full-text

The isolation and amplification of full length cDNA of oleosins from oil palm (Elaeis guineensis Jacq.)

AFRICAN JOURNAL OF BIOTECHNOLOGY ◽

10.5897/ajb09.1248 ◽

2010 ◽

Vol 9 (13) ◽

pp. 1859-1863 ◽

Cited By ~ 1

Author(s):

Binti Jamek Shariza ◽

Gek Cheng Ngoh ◽

Teon Guan Chuah

Keyword(s):

Oil Palm ◽

Elaeis Guineensis ◽

Full Length ◽

Full Length Cdna ◽

Elaeis Guineensis Jacq

Download Full-text

Cloning and expression of a plastid-encoded subunit, beta-carboxyltransferase gene (accD) and a nuclear-encoded subunit, biotin carboxylase of acetyl-CoA carboxylase from oil palm (Elaeis guineensis Jacq.)

Plant Science ◽

10.1016/j.plantsci.2008.05.023 ◽

2008 ◽

Vol 175 (4) ◽

pp. 497-504 ◽

Cited By ~ 29

Author(s):

Alisa Nakkaew ◽

Wilaiwan Chotigeat ◽

Theera Eksomtramage ◽

Amornrat Phongdara

Keyword(s):

Oil Palm ◽

Elaeis Guineensis ◽

Cloning And Expression ◽

Biotin Carboxylase ◽

Acetyl Coa Carboxylase ◽

Acetyl Coa ◽

Elaeis Guineensis Jacq

Download Full-text

Ekspresi gen penyandi ACCase subunit biotin karboksilase dari mesokarp buah kelapa sawit pada Escherichia coli Expression of gene encoding ACCase subunit biotin carboxylase from oil palm fruit mesocarp in Escherichia coli

E-Journal Menara Perkebunan ◽

10.22302/iribb.jur.mp.v82i1.29 ◽

2016 ◽

Vol 82 (1) ◽

Author(s):

Asmini BUDIANI

Keyword(s):

Escherichia Coli ◽

Oil Palm ◽

Biotin Carboxylase ◽

Acetyl Coa Carboxylase ◽

Acetyl Coa ◽

Gene Encoding ◽

Palm Fruit ◽

E Coli ◽

Target Dna ◽

Sds Page

Abstract Production of palm oil could be increased, one of which is by increasing oil content in the mesocarp of oil palm. This might be done by increasing the activity of key enzymes of the oil biosynthesis pathway in the oil palm mesocarp. Acetyl-CoA carboxylase has been reported as the enzyme that plays important role in oil accumulation in the oil palm mesocarp. Gene encoding one subunit of ACCase, biotin carboxylase (BC) had been isolated from oil palm mesocarp and cloned in E. coli. This reseach was aimed to examine the expression of the cloned BC gene in the E. coli. The cloned cDNA encoding BC was reisolated from recom-binant E. coli by PCR using spesific primers. The PCR products were verified in the agarose gel, and then ligated to pTrcHis-TOPO expression vector. The ligation product, recombinant vector pTrcHis-TOPO/BC, was introduced into E. coli XL1-Blue. Recombinant colonies grew in the selection media were analyzed using PCR to confirm the existent of the target DNA. The colonies, which have been confirmed to contain target DNA were then subcultured in the LB media, for extraction of total protein. The protein extract was then analyzed quantitatively by Lowry method, and qualitatively by electrophoresis on SDS polyacrylamide gel. The result showed that recombinant plasmid pTrcHis-TOPO/BC has been successfully inserted into E. coli XL-1 Blue. SDS-PAGE analysis of the extracted protein showed that recombinant E. coli produced specific protein with MW of about 43 kDa, much higher compared with that of untransformed E. coli. This results demonstrate that the cloned BC was strongly expressed in E. coli Abastrak Produksi minyak sawit dapat ditingkatkan, salah satu-nya dengan meningkatkan rendemen minyak. Hal ini dapat dilakukan dengan cara meningkatkan aktivitas enzim kunci biosintesis minyak pada mesokarp buah sawit. Acetyl-CoA carboxylase telah dilaporkan merupakan enzim yang berperan penting dalam akumulasi minyak pada mesokarp kelapa sawit. Pada penelitian sebelumnya, gen penyandi salah satu subunit ACCase, yaitu biotin carboxylase (BC), telah diisolasi dari jaringan mesokarp kelapa sawit dan diklon pada E.coli. Tujuan penelitian ini adalah untuk menguji ekspresi gen tersebut pada E. coli. cDNA penyandi BC diisolasi kembali dari E. coli rekombinan dengan PCR menggunakan pasangan primer spesifik. Hasil isolasi diveri-fikasi pada gel agarose, kemudian diligasikan dengan vektor ekspresi pTrcHis-TOPO. Vektor rekombinan (pTrcHis-TOPO/BC) hasil ligasi diintroduksikan ke dalam E. coli XL1-Blue. Koloni rekombinan yang tumbuh pada media seleksi dianalisis menggunakan PCR untuk mengkonfirmasi ada tidaknya sisipan DNA target. Koloni yang terbukti mengandung sisipan DNA target dikulturkan pada media LB kemudian protein total diekstrak dari kultur E. coli dan dianalisis dengan elektroforesis SDS-PAGE. Hasil PCR koloni menunjukkan bahwa transformasi E. Coli XL-1 Blue menggunakan konstruk vektor rekombinan pTrcHis-TOPO/ BC berhasil baik. Analisis SDS-PAGE dari ekstrak protein menunjukkan bahwa E. coli rekombinan menghasilkan protein dengan berat molekul sekitar 43 kDa yang inten-sitasnya jauh lebih tinggi dibandingkan dengan protein yang sama yang dihasilkan oleh E. coli yang tidak ditrans-formasi. Hal ini membuktikan bahwa gen penyandi BC dalam vektor pTrcHis-TOPO dapat diekspresikan dengan kuat pada E. coli.

Download Full-text

Ekspresi gen penyandi ACCase subunit biotin karboksilase dari mesokarp buah kelapa sawit pada Escherichia coli Expression of gene encoding ACCase subunit biotin carboxylase from oil palm fruit mesocarp in Escherichia coli

E-Journal Menara Perkebunan ◽

10.22302/ppbbi.jur.mp.v82i1.29 ◽

2016 ◽

Vol 82 (1) ◽

Author(s):

Asmini BUDIANI

Keyword(s):

Escherichia Coli ◽

Oil Palm ◽

Biotin Carboxylase ◽

Acetyl Coa Carboxylase ◽

Acetyl Coa ◽

Gene Encoding ◽

Palm Fruit ◽

E Coli ◽

Target Dna ◽

Sds Page

Abstract Production of palm oil could be increased, one of which is by increasing oil content in the mesocarp of oil palm. This might be done by increasing the activity of key enzymes of the oil biosynthesis pathway in the oil palm mesocarp. Acetyl-CoA carboxylase has been reported as the enzyme that plays important role in oil accumulation in the oil palm mesocarp. Gene encoding one subunit of ACCase, biotin carboxylase (BC) had been isolated from oil palm mesocarp and cloned in E. coli. This reseach was aimed to examine the expression of the cloned BC gene in the E. coli. The cloned cDNA encoding BC was reisolated from recom-binant E. coli by PCR using spesific primers. The PCR products were verified in the agarose gel, and then ligated to pTrcHis-TOPO expression vector. The ligation product, recombinant vector pTrcHis-TOPO/BC, was introduced into E. coli XL1-Blue. Recombinant colonies grew in the selection media were analyzed using PCR to confirm the existent of the target DNA. The colonies, which have been confirmed to contain target DNA were then subcultured in the LB media, for extraction of total protein. The protein extract was then analyzed quantitatively by Lowry method, and qualitatively by electrophoresis on SDS polyacrylamide gel. The result showed that recombinant plasmid pTrcHis-TOPO/BC has been successfully inserted into E. coli XL-1 Blue. SDS-PAGE analysis of the extracted protein showed that recombinant E. coli produced specific protein with MW of about 43 kDa, much higher compared with that of untransformed E. coli. This results demonstrate that the cloned BC was strongly expressed in E. coli Abastrak Produksi minyak sawit dapat ditingkatkan, salah satu-nya dengan meningkatkan rendemen minyak. Hal ini dapat dilakukan dengan cara meningkatkan aktivitas enzim kunci biosintesis minyak pada mesokarp buah sawit. Acetyl-CoA carboxylase telah dilaporkan merupakan enzim yang berperan penting dalam akumulasi minyak pada mesokarp kelapa sawit. Pada penelitian sebelumnya, gen penyandi salah satu subunit ACCase, yaitu biotin carboxylase (BC), telah diisolasi dari jaringan mesokarp kelapa sawit dan diklon pada E.coli. Tujuan penelitian ini adalah untuk menguji ekspresi gen tersebut pada E. coli. cDNA penyandi BC diisolasi kembali dari E. coli rekombinan dengan PCR menggunakan pasangan primer spesifik. Hasil isolasi diveri-fikasi pada gel agarose, kemudian diligasikan dengan vektor ekspresi pTrcHis-TOPO. Vektor rekombinan (pTrcHis-TOPO/BC) hasil ligasi diintroduksikan ke dalam E. coli XL1-Blue. Koloni rekombinan yang tumbuh pada media seleksi dianalisis menggunakan PCR untuk mengkonfirmasi ada tidaknya sisipan DNA target. Koloni yang terbukti mengandung sisipan DNA target dikulturkan pada media LB kemudian protein total diekstrak dari kultur E. coli dan dianalisis dengan elektroforesis SDS-PAGE. Hasil PCR koloni menunjukkan bahwa transformasi E. Coli XL-1 Blue menggunakan konstruk vektor rekombinan pTrcHis-TOPO/ BC berhasil baik. Analisis SDS-PAGE dari ekstrak protein menunjukkan bahwa E. coli rekombinan menghasilkan protein dengan berat molekul sekitar 43 kDa yang inten-sitasnya jauh lebih tinggi dibandingkan dengan protein yang sama yang dihasilkan oleh E. coli yang tidak ditrans-formasi. Hal ini membuktikan bahwa gen penyandi BC dalam vektor pTrcHis-TOPO dapat diekspresikan dengan kuat pada E. coli.

Download Full-text

Kloning fragmen gen penyandi β-ketoacyl-ACP synthase II dari dua tipe kelapa sawit dengan kandungan asam oleat yang berbeda Cloning of gene fragment encoding β-ketoacyl-ACP synthase II from two types of oil palm with different oleic acid content

E-Journal Menara Perkebunan ◽

10.22302/ppbbi.jur.mp.v78i1.73 ◽

2016 ◽

Vol 78 (1) ◽

Author(s):

Asmini BUDIANI1 ◽

Abdul Razak PURBA

Keyword(s):

Oleic Acid ◽

Genetic Engineering ◽

Oil Palm ◽

Acid Content ◽

Elaeis Guineensis ◽

Oleic Acid Content ◽

Rt Pcr ◽

Gene Encoding ◽

Elaeis Oleifera ◽

E Coli

AbstractIn addition to increase productivity, oil palm breeding is also aimed to increase oil quality, one of which is oleic acid content. Conventionally, the increase of oleic acid is carried out by crossing between Elaeis guineensis which is high in oilcontent and Elaeis oleifera which contain high oleic acid. Genetic engineering to increase oleic acid might be done by over expressing gene encoding β-Ketoacyl-ACP Synthase II (KASII) in the mesocarp of oil palm. As a preliminary workof genetic engineering to increase oleic acid content, this research was aimed to clone DNA fragment of gene encoding KASII by using RT-PCR. Total RNA were isolated from the mesocarp of two different types of oil palms, namelySimalungun (E. guineensis) and Hibrida (E. guineensi x E. oleifera), and used for synthesis of first strand cDNA. Amplification of KASII DNA fragments was carried out using first strand cDNA as a template with specific primers. TheRT-PCR product was verified by electrophoresis on agarose gel, isolated and purified from the gel, sequenced and then cloned into E. coli using pGEM-T Easy cloning vector. Analysis of the target DNA in transformed E. coli was done by colony PCR. Recombinant plasmid was isolated from recombinant E. coli followed by DNA sequencing and analysis. DNA sequences were analysed using BLASTn to test the homology with similar genes. The results show that DNAfragment of RT-PCR products from Simalungun and Hibrida types of oil palm have been cloned in E. coli, and the sequences have been confirmed as a fragment of KASII gene. Analysis of the two sequences indicated that there were differences of four nucleotides at position no of 91, 103, 115, and 148. AbstrakSelain meningkatkan produksi, pemuliaan kelapa sawit juga ditujukan untuk meningkatkan kualitas minyak sawit, salah satunya adalah meningkatkan kandungan oleat. Secara konvensional peningkatan kandungan oleat dilakukan melalui penyilangan antara Elaeis guineensis yang tinggi rendemenminyaknya dengan Elaeis oleifera yang tinggi kandungan oleatnya. Rekayasa genetika untuk peningkatan kandungan oleat dapat ditempuh antara lain dengan mening-katkan ekspresi gen penyandi β-Ketoacyl-ACP Synthase II (KASII)pada mesokarp buah sawit. Sebagai bagian dari upaya peningkatan kandungan oleat, penelitian ini bertujuan untuk mengklon fragmen gen penyandi KASII dengan pendekatanRT-PCR. RNA total diisolasi dari mesokarp dua tipe kelapasawit yaitu Simalungun dan Hibrida (E. guineensis x E. oleifera), kemudian digunakan dalam sintesis utas pertama cDNA. Amplifikasi fragmen DNA penyandi KASII dilakukan menggunakan primer spesifik dan templat cDNAutas pertama hasil sintesis. Produk RT-PCR diverifikasi dengan elektroforesis pada gel agarosa, diisolasi dan dimurnikan dari gel, disekuen kemudian diklon dalam E. coli menggunakan vektor kloning pGEM-T Easy. Analisis adanyafragmen DNA target dalam sel E. coli transforman dilakukan dengan PCR koloni. Plasmid rekombinan diisolasi dari sel rekombinan dan diverifikasi pada gel agarose kemudian disekuen kembali untuk mengkonfirmasi bahwa fragmenDNA terklon adalah bagian dari gen penyandi KASII. Sekuen DNA dianalisis menggunakan BLASTn untuk mengetahui homologinya dengan gen yang sama. Hasil penelitian menunjukkan bahwa fragmen DNA produk RTPCR dari kelapa sawit tipe Simalungun dan Hibrida telah terklon dalam E. coli dan sekuen DNAnya dikonfirmasi sebagai fragmen gen penyandi KASII. Hasil analisis sekuen DNA KASII dari tipe Simalungun dengan tipe Hibrida juga mengindikasikan adanya perbedaan pada empat nukleotida yaitu pada posisi ke-91, ke-103, ke-115, dan ke-148.

Download Full-text

Kloning parsial gen penyandi enoil-ACP reduktase dari mesokarp buah kelapa sawit (Elaeis guineensis Jacq.) Partial cloning of gene encoding enoyl-ACP reductase from mesocarp of oil palm (Elaeis guineensis Jacq.)

E-Journal Menara Perkebunan ◽

10.22302/ppbbi.jur.mp.v72i1.126 ◽

2016 ◽

Vol 72 (1) ◽

Author(s):

Asmini BUDIANI ◽

Djoko SANTOSO ◽

Hajrial ASWIDINNOOR ◽

Antonius SUWANTO

Keyword(s):

Fatty Acid ◽

Oil Palm ◽

Fatty Acid Synthase ◽

Elaeis Guineensis ◽

Rt Pcr ◽

Gene Encoding ◽

Oil Accumulation ◽

Enoyl Acp Reductase ◽

Conserved Region ◽

Elaeis Guineensis Jacq

Summary Enoyl-ACP reductase (ENR) is a component of fatty acid synthase (FAS) that is considered to play an important role in fatty acid elongation and oil accumulation of several plants. One of the proteins expressed coinciding with fruit development and oil accumulation in oil palm has been detected from the previous study and had homology with ENR. Therefore, as a part of genetic engineering program to improve oil content and quality in oil palm mesocarp, this research was aimed to clone cDNA conserved region of gene encoding enoyl-ACP reductase from oil palm mesocarp. Based on the amino acid sequence of the polypeptide that was homologous with ENR and combined with information of conserved region sequences of the same gene from other plant sources, primers were designed for amplifying conserved region of the ENR gene. Amplifi-cation was carried out by RT-PCR using total RNA as template, at several annealing temperatures and MgCl2 concentrations. Amplification product was cloned using pCR 2.1-TOPO, and the sequence was subjected into BlastN analysis. The results confirmed that the cloned cDNA fragment with 698 bp in size was the conserved region of the ENR gene. This sequence was highly homologous with the same gene from other plants such as Oryza sativa, Olea europaea, Brassica napus, Triticum aestivum and Arabidopsis thaliana with E-value 1e-96, 7e-77, 2e-64, 5e-41 and 3e-36, respectively. Based on this result, primers have been made and used to amplify the 5’- and 3’ ends of the ENR -cDNA of oil palm mesocarp. Ringkasan Enoil-ACP reduktase (ENR) merupakan salah satu komponen asam lemak sintase (FAS) yang berperan penting dalam pemanjangan asam lemak dan akumulasi minyak pada berbagai tanaman. Salah satu protein yang ter-ekspresi sejalan dengan tahapan perkembangan buah sawit dan akumulasi minyak pada penelitian sebelumnya diketahui mempunyai homologi dengan ENR. Oleh karena itu, sebagai salah satu bagian dari usaha rekayasa metabolisme minyak pada mesokarp buah sawit, penelitian ini bertujuan untuk mengklon cDNA daerah konservatif gen penyandi ENR dari mesokarp buah sawit. Berdasarkan sekuen asam amino polipeptida yang mempunyai homologi dengan ENR dan dikombinasikan dengan hasil penjajaran daerah konservatif gen tersebut dari berbagai anaman lain, dirancang primer untuk amplifikasi daerah konservatif ENR. Amplifikasi dilakukan dengan RT-PCR menggunakan templat RNA total pada berbagai suhu penempelan dan konsentrasi MgCl2. Hasil amplifikasi dimurnikan dari gel dan diklon menggunakan vektor kloning pCR2.1-TOPO serta dianalisis nya menggunakan BlastN. Hasilnya mengkonfirmasi fragmen cDNA terklon berukuran 698 pb sebagai daerah konservatif ENR tersebut mempunyai homologi tinggi dengan gen yang sama dari O. sativa, O. europaea, B. napus, T. aestivum dan A. thaliana masing-masing dengan E-value 1e-96, 7e-77, 2e-64, 5e-41 dan 3e-36. Berdasarkan hasil tersebut telah dibuat primer spesifik untuk amplifikasi cDNA daerah ujung 5’- dan 3’- gen ENR dari mesokarp kelapa

Download Full-text

Kloning parsial gen penyandi enoil-ACP reduktase dari mesokarp buah kelapa sawit (Elaeis guineensis Jacq.) Partial cloning of gene encoding enoyl-ACP reductase from mesocarp of oil palm (Elaeis guineensis Jacq.)

E-Journal Menara Perkebunan ◽

10.22302/iribb.jur.mp.v72i1.126 ◽

2016 ◽

Vol 72 (1) ◽

Author(s):

Asmini BUDIANI ◽

Djoko SANTOSO ◽

Hajrial ASWIDINNOOR ◽

Antonius SUWANTO

Keyword(s):

Fatty Acid ◽

Oil Palm ◽

Fatty Acid Synthase ◽

Elaeis Guineensis ◽

Rt Pcr ◽

Gene Encoding ◽

Oil Accumulation ◽

Enoyl Acp Reductase ◽

Conserved Region ◽

Elaeis Guineensis Jacq

Summary Enoyl-ACP reductase (ENR) is a component of fatty acid synthase (FAS) that is considered to play an important role in fatty acid elongation and oil accumulation of several plants. One of the proteins expressed coinciding with fruit development and oil accumulation in oil palm has been detected from the previous study and had homology with ENR. Therefore, as a part of genetic engineering program to improve oil content and quality in oil palm mesocarp, this research was aimed to clone cDNA conserved region of gene encoding enoyl-ACP reductase from oil palm mesocarp. Based on the amino acid sequence of the polypeptide that was homologous with ENR and combined with information of conserved region sequences of the same gene from other plant sources, primers were designed for amplifying conserved region of the ENR gene. Amplifi-cation was carried out by RT-PCR using total RNA as template, at several annealing temperatures and MgCl2 concentrations. Amplification product was cloned using pCR 2.1-TOPO, and the sequence was subjected into BlastN analysis. The results confirmed that the cloned cDNA fragment with 698 bp in size was the conserved region of the ENR gene. This sequence was highly homologous with the same gene from other plants such as Oryza sativa, Olea europaea, Brassica napus, Triticum aestivum and Arabidopsis thaliana with E-value 1e-96, 7e-77, 2e-64, 5e-41 and 3e-36, respectively. Based on this result, primers have been made and used to amplify the 5’- and 3’ ends of the ENR -cDNA of oil palm mesocarp. Ringkasan Enoil-ACP reduktase (ENR) merupakan salah satu komponen asam lemak sintase (FAS) yang berperan penting dalam pemanjangan asam lemak dan akumulasi minyak pada berbagai tanaman. Salah satu protein yang ter-ekspresi sejalan dengan tahapan perkembangan buah sawit dan akumulasi minyak pada penelitian sebelumnya diketahui mempunyai homologi dengan ENR. Oleh karena itu, sebagai salah satu bagian dari usaha rekayasa metabolisme minyak pada mesokarp buah sawit, penelitian ini bertujuan untuk mengklon cDNA daerah konservatif gen penyandi ENR dari mesokarp buah sawit. Berdasarkan sekuen asam amino polipeptida yang mempunyai homologi dengan ENR dan dikombinasikan dengan hasil penjajaran daerah konservatif gen tersebut dari berbagai anaman lain, dirancang primer untuk amplifikasi daerah konservatif ENR. Amplifikasi dilakukan dengan RT-PCR menggunakan templat RNA total pada berbagai suhu penempelan dan konsentrasi MgCl2. Hasil amplifikasi dimurnikan dari gel dan diklon menggunakan vektor kloning pCR2.1-TOPO serta dianalisis nya menggunakan BlastN. Hasilnya mengkonfirmasi fragmen cDNA terklon berukuran 698 pb sebagai daerah konservatif ENR tersebut mempunyai homologi tinggi dengan gen yang sama dari O. sativa, O. europaea, B. napus, T. aestivum dan A. thaliana masing-masing dengan E-value 1e-96, 7e-77, 2e-64, 5e-41 dan 3e-36. Berdasarkan hasil tersebut telah dibuat primer spesifik untuk amplifikasi cDNA daerah ujung 5’- dan 3’- gen ENR dari mesokarp kelapa

Download Full-text

Kloning fragmen gen penyandi β-ketoacyl-ACP synthase II dari dua tipe kelapa sawit dengan kandungan asam oleat yang berbeda Cloning of gene fragment encoding β-ketoacyl-ACP synthase II from two types of oil palm with different oleic acid content

E-Journal Menara Perkebunan ◽

10.22302/iribb.jur.mp.v78i1.73 ◽

2016 ◽

Vol 78 (1) ◽

Author(s):

Asmini BUDIANI1 ◽

Abdul Razak PURBA

Keyword(s):

Oleic Acid ◽

Genetic Engineering ◽

Oil Palm ◽

Acid Content ◽

Elaeis Guineensis ◽

Oleic Acid Content ◽

Rt Pcr ◽

Gene Encoding ◽

Elaeis Oleifera ◽

E Coli

AbstractIn addition to increase productivity, oil palm breeding is also aimed to increase oil quality, one of which is oleic acid content. Conventionally, the increase of oleic acid is carried out by crossing between Elaeis guineensis which is high in oilcontent and Elaeis oleifera which contain high oleic acid. Genetic engineering to increase oleic acid might be done by over expressing gene encoding β-Ketoacyl-ACP Synthase II (KASII) in the mesocarp of oil palm. As a preliminary workof genetic engineering to increase oleic acid content, this research was aimed to clone DNA fragment of gene encoding KASII by using RT-PCR. Total RNA were isolated from the mesocarp of two different types of oil palms, namelySimalungun (E. guineensis) and Hibrida (E. guineensi x E. oleifera), and used for synthesis of first strand cDNA. Amplification of KASII DNA fragments was carried out using first strand cDNA as a template with specific primers. TheRT-PCR product was verified by electrophoresis on agarose gel, isolated and purified from the gel, sequenced and then cloned into E. coli using pGEM-T Easy cloning vector. Analysis of the target DNA in transformed E. coli was done by colony PCR. Recombinant plasmid was isolated from recombinant E. coli followed by DNA sequencing and analysis. DNA sequences were analysed using BLASTn to test the homology with similar genes. The results show that DNAfragment of RT-PCR products from Simalungun and Hibrida types of oil palm have been cloned in E. coli, and the sequences have been confirmed as a fragment of KASII gene. Analysis of the two sequences indicated that there were differences of four nucleotides at position no of 91, 103, 115, and 148. AbstrakSelain meningkatkan produksi, pemuliaan kelapa sawit juga ditujukan untuk meningkatkan kualitas minyak sawit, salah satunya adalah meningkatkan kandungan oleat. Secara konvensional peningkatan kandungan oleat dilakukan melalui penyilangan antara Elaeis guineensis yang tinggi rendemenminyaknya dengan Elaeis oleifera yang tinggi kandungan oleatnya. Rekayasa genetika untuk peningkatan kandungan oleat dapat ditempuh antara lain dengan mening-katkan ekspresi gen penyandi β-Ketoacyl-ACP Synthase II (KASII)pada mesokarp buah sawit. Sebagai bagian dari upaya peningkatan kandungan oleat, penelitian ini bertujuan untuk mengklon fragmen gen penyandi KASII dengan pendekatanRT-PCR. RNA total diisolasi dari mesokarp dua tipe kelapasawit yaitu Simalungun dan Hibrida (E. guineensis x E. oleifera), kemudian digunakan dalam sintesis utas pertama cDNA. Amplifikasi fragmen DNA penyandi KASII dilakukan menggunakan primer spesifik dan templat cDNAutas pertama hasil sintesis. Produk RT-PCR diverifikasi dengan elektroforesis pada gel agarosa, diisolasi dan dimurnikan dari gel, disekuen kemudian diklon dalam E. coli menggunakan vektor kloning pGEM-T Easy. Analisis adanyafragmen DNA target dalam sel E. coli transforman dilakukan dengan PCR koloni. Plasmid rekombinan diisolasi dari sel rekombinan dan diverifikasi pada gel agarose kemudian disekuen kembali untuk mengkonfirmasi bahwa fragmenDNA terklon adalah bagian dari gen penyandi KASII. Sekuen DNA dianalisis menggunakan BLASTn untuk mengetahui homologinya dengan gen yang sama. Hasil penelitian menunjukkan bahwa fragmen DNA produk RTPCR dari kelapa sawit tipe Simalungun dan Hibrida telah terklon dalam E. coli dan sekuen DNAnya dikonfirmasi sebagai fragmen gen penyandi KASII. Hasil analisis sekuen DNA KASII dari tipe Simalungun dengan tipe Hibrida juga mengindikasikan adanya perbedaan pada empat nukleotida yaitu pada posisi ke-91, ke-103, ke-115, dan ke-148.

Download Full-text