scholarly journals Analysis of intrinsic apoptosis in endothelial cells exposed to calcium phosphate bions

2020 ◽  
Vol 5 (3) ◽  
pp. 50-58
Author(s):  
V. E. Markova ◽  
D. K. Shishkova ◽  
A. G. Kutikhin
Keyword(s):  
Endothelial Cells ◽  
Calcium Phosphate ◽  
Cytochrome C ◽  
Total Protein ◽  
Subcellular Fractionation ◽  
Intrinsic Apoptosis ◽  
Human Coronary Artery ◽  
Caspase 9 ◽  
Arterial Endothelial Cells ◽  
Apoptosis Proteins

Aim. To study intrinsic apoptosis in primary arterial endothelial cells treated with calcium phosphate bions (CPB). Materials and Methods. Primary human coronary artery endothelial cells were exposed to spherical or needle-shaped CPB during 4 hours with the subsequent extraction of total protein and subcellular fractionation to separate mitochondrial and cytosolic protein. We then performed Western blotting to measure the relative levels of a mitochondrial marker porin, cytosolic marker glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase and intrinsic apoptosis proteins cytochrome c and HtrA2/Omi in mitochondria and cytosol in addition to the levels of total and cleaved caspases-9 and caspases-3 in the total protein collected from three independent experiments. Results. Translocation of cytochrome c and HtrA2/Omi was not a mandatory consequence of CPB exposure. Relative levels of the measured proteins differed according to the particle shape. Out of three experiments, only one showed a significant increase in cleaved caspase-9 and caspase-3 in CPB-treated as compared with the mock-treated cells. In other experiments, cleaved caspases did not show a consistent elevation. The levels of total and cleaved caspase-9 and caspases-3 were concordant testifying to the direct correlation between them. Conclusion. As mechanisms of CPB-induced endothelial toxicity are poorly defined, they require further investigation employing optimized methods.

SPECIFIC TOXICITY OF CALCIUM PHOSPHATE BIONS FOR HUMAN VENOUS AND ARTERIAL ENDOTHELIAL CELLS

2019 ◽  
pp. 53-61
Author(s):  
Д.К. Шишкова ◽  
Е.А. Великанова ◽  
В.Г. Матвеева ◽  
Ю.А. Кудрявцева ◽  
А.Г. Кутихин
Keyword(s):  
Endothelial Cells ◽  
Coronary Artery ◽  
Calcium Phosphate ◽  
Exposure Time ◽  
Internal Thoracic Artery ◽  
Human Coronary Artery ◽  
Hoechst 33342 ◽  
Ethidium Bromide Staining ◽  
Induced Apoptosis ◽  
Arterial Endothelial Cells

Цель исследования - оценка токсичности кальций-фосфатных бионов (КФБ) и магний-фосфатных бионов (МФБ) для культур эндотелиальных клеток. Методика. Эндотелиотоксичность бионов изучена при помощи добавления равных концентраций МФБ или КФБ к: 1) разреженным или конфлюэнтным культурам иммортализованных венозных эндотелиальных клеток человека линии EA.hy 926 с последующим культивированием в течение 24 ч или 4 ч соответственно; 2) конфлюэнтным культурам коммерческих первичных эндотелиальных клеток коронарной и внутренней грудной артерии человека с последующим культивированием в течение 24 ч. Эндотелиотоксические эффекты бионов оценивали при помощи сочетанного окрашивания клеток флюоресцентными красителями Hoechst 33342 и бромистым этидием, а также посредством колориметрического теста. Кроме того, методом проточной цитометрии оценивали пути и стадии гибели клеток вышеуказанных культур. Результаты. В отличие от МФБ, КФБ индуцировали гибель эндотелиальных клеток всех 3 линий путем апоптоза. Устойчивость культур к токсическому действию КФБ определялась степенью их конфлюэнтности (конфлюэнтные культуры более устойчивы чем разреженные) и типом клеточной линии (эндотелиальные клетки внутренней грудной артерии продемонстрировали большую устойчивость в сравнении с эндотелиальными клетками коронарной артерии). Заключение. Токсичность КФБ для культур эндотелиальных клеток специфична, то есть определяется их специфическим минеральным составом, а не общей для всех типов бионов корпускулярной природой. Добавление КФБ к конфлюэнтным культурам первичных артериальных эндотелиальных клеток и к иммортализованным венозным эндотелиальным клеткам вызывало их гибель, при этом экспозиция МФБ не оказывает значимого токсического действия. Эндотелиальные клетки внутренней грудной артерии менее чувствительны к воздействию КФБ в сравнении с эндотелиальными клетками коронарной артерии человека. Aim. To compare toxicity of calcium phosphate bions (CPB) and magnesium phosphate bions (MPB) for endothelial cells. Me-thods. To assess endothelial toxicity of the bions, we first added equal concentrations of either MPB or CPB to: 1) non-confluent or confluent cultures of immortalized human venous endothelial cells EA.hy 926 with the exposure time of 24 h or 4 h, respectively; 2) confluent cultures of commercially available primary human coronary artery and internal thoracic artery endothelial cells, with the exposure time of 24 h. Endothelial toxicity was then evaluated by combined Hoechst 33342 and ethidium bromide staining following fluorescence microscopy and by colorimetric cytotoxicity assay. In addition, we attempted to determine the pathway of bion-induced cell death utilizing flow cytometry. Results. In contrast to the MPB, CPB induced apoptosis of all studied endothelial cell lines. Resistance of endothelial cells to the CPB was defined by their confluence (confluent cultures demonstrated higher resistance), and cell type (internal thoracic artery endothelial cells were more resistant to the CPB as compared to the coronary artery endothelial cells). Conclusions. Endothelial toxicity of the CPB is defined by their specific mineral composition but not by their corpuscular nature, which is common for all nanoparticles. Addition of the CPB to the confluent cultures of primary human arterial cells and to immortalized human venous endothelial cells evoked their death. On the contrary, exposure to the MPB did not cause any toxic effects. Human internal thoracic artery endothelial cells are more resistant to the CPB in comparison with coronary artery endothelial cells.

Detection of oxidative stress induced by calcium phosphate bions in human arterial endothelial cells

2021 ◽  
pp. 70-78
Author(s):  
А.Г. Кутихин ◽  
Д.К. Шишкова ◽  
Р.А. Мухамадияров ◽  
Е.А. Великанова
Keyword(s):  
Oxidative Stress ◽  
Reactive Oxygen Species ◽  
Endothelial Cells ◽  
Cell Death ◽  
Superoxide Dismutase ◽  
Calcium Phosphate ◽  
Reactive Oxygen ◽  
Oxygen Species ◽  
Bafilomycin A1 ◽  
Arterial Endothelial Cells

Введение. Кальций-фосфатные бионы (КФБ) формируются в организме человека при перенасыщении сыворотки ионами кальция и фосфора и вызывают дисфункцию эндотелия, однако молекулярные механизмы нарушения функционирования эндотелия при воздействии КФБ не ясны. Цель исследования - выяснение роли кальций-фосфатных бионов различной формы в развитии окислительного стресса в артериальных эндотелиальных клетках (ЭК) человека. Методика. Для детекции окислительного стресса к конфлюэнтным культурам первичных ЭК коронарной и внутренней грудной артерии человека добавляли равные концентрации КФБ сферической или игольчатой формы (СКФБ и ИКФБ соответственно) с последующим культивированием в течение 1 и 4 ч, добавлением флюоресцентных индикаторов окислительного стресса MitoSOX Red и CellROX Green и конфокальной микроскопией. Измеряли концентрацию продуктов перекисного окисления липидов в культуральной жидкости через 24 ч экспозиции эндотелиальных клеток КФБ. Анализ нейтрализации цитотоксических эффектов перекисного окисления липидов проводили путем добавления к ЭК супероксиддисмутазы и каталазы на 4 или 24 ч (одновременно с КФБ). Для сравнения механизмов клеточной гибели при воздействии СКФБ и ИКФБ анализировали цитотоксичность обоих типов бионов при одновременном воздействии лизосомального ингибитора бафиломицина А1. Результаты. Значимого увеличения генерации активных форм кислорода (АФК) в результате экспозиции СКФБ (независимо от линии ЭК и продолжительности экспозиции) не было выявлено. В то же время наблюдалось повышение генерации супероксида через 4 ч, а иных свободных радикалов через 1 ч после добавления ИКФБ к ЭК. Предварительная нейтрализация АФК супероксиддисмутазой и каталазой частично защищала ЭК от индуцируемой ИКФБ гибели. При этом добавление бафиломицина А1 к ЭК частично защищало их от гибели только при воздействии СКФБ, но не ИКФБ. Заключение. Гибель ЭК при воздействии СКФБ происходит в результате первичного повреждения лизосом, а при воздействии ИКФБ - в первую очередь вследствие окислительного стресса. Background. Calcium phosphate bions (CPB) form in the human blood upon its supersaturation with calcium and phosphate and provoke endothelial dysfunction; however, the molecular mechanisms of these pathological processes remain unclear. Aim. To elucidate the role of differently shaped CPBs in induction of oxidative stress in human arterial endothelial cells (Ecs). Methods. For detection of oxidative stress, equal concentrations of spherical CPB (CPB-S) or needle-shaped CPB (CPB-N) were added to confluent cultures of primary human coronary artery and internal thoracic artery ECs for 1 and 4 h; this was followed by MitoSOX Red and CellROX Green staining and subsequent confocal microscopy. Concentration of thiobarbituric acid-reactive substances was measured in the EC culture supernatant at 24 h of the CPB exposure. The lipid peroxidation cytotoxicity was neutralized by adding superoxide dismutase and catalase to ECs for 4 or 24 h. To compare cell death subroutines induced by CPB-S and CPB-N, the effect of bafilomycin A1, a lysosomal inhibitor, on CRB cytotoxicity was studied. Results. No increase in reactive oxygen species generation was observed in the CPB-S exposure, regardless of the EC line and exposure duration. However, addition of CPB-N to ECs increased the production of superoxide and other free radicals after four- and one-hour exposure, respectively. Prior neutralization of reactive oxygen species with superoxide dismutase and catalase partially protected ECs from CPB-N- but not CPB-S-induced death while bafilomycin A1, vice versa, protected ECs from CPB-S- but not CPB-N-induced death. Conclusion. CPB-S cause cell death due to primary damage of lysosomes whereas CPB-N induce apoptosis due to oxidative stress.

scholarly journals Calcium phosphate bions cause increased release of interleukin-6 and interleukin-8 in primary arterial endothelial cells regardless of their shape

2020 ◽  
pp. 53-60
Author(s):  
А.Г. Кутихин ◽  
Д.К. Шишкова ◽  
М.Ю. Синицкий ◽  
Е.А. Великанова
Keyword(s):  
Endothelial Cells ◽  
Calcium Phosphate ◽  
Interleukin 6 ◽  
Transcript Level ◽  
Interleukin 8 ◽  
Cell Culture Supernatant ◽  
Enzyme Linked Immunosorbent Assay ◽  
Secretion Profile ◽  
Factor Α ◽  
Arterial Endothelial Cells

Актуальность. Кальций-фосфатные бионы (КФБ) формируются при перенасыщении крови ионами кальция и фосфора и, циркулируя в кровотоке, повреждают эндотелиальные клетки (ЭК), при растворении в лизосомах вызывая их лизосомально-опосредованную клеточную гибель, которая может сопровождаться выделением провоспалительных цитокинов в микроокружение. Цель исследования. Оценить профиль секреции провоспалительных цитокинов первичными артериальными ЭК человека под воздействием сферических КФБ (СКФБ) и игольчатых КФБ (ИКФБ). Материалы и методы. СКФБ и ИКФБ в равных концентрациях (100 мкл, оптическая плотность суспензии на длине волны 650 нм 0,08-0,10) были добавлены к конфлюэнтным культурам первичных ЭК коронарной и внутренней грудной артерии человека в 6-луночных планшетах. Культуральная жидкость забиралась после 24 часов культивирования с последующим измерением в ней уровня провоспалительных цитокинов (интерлейкин(ИЛ)-1β, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-10, ИЛ-12, ИЛ-23, фактор некроза опухоли-α, γ-интерферон) посредством иммуноферментного анализа. Кроме того, из клеточной массы выделяли РНК посредством соответствующих колонок с последующей обратной транскрипцией для синтеза кДНК и оценкой экспрессии генов, кодирующих вышеуказанные цитокины (IL1B, IL6, CXCL8, IL10, IL12A, IL12B, IL23, TNF, IFNG) и некоторые рецепторы к ним (IL1R1, IL1R2, TNFRSF1A, TNFRSF1B), методом количественной полимеразной цепной реакции. Результаты. Воздействие СКФБ и ИКФБ приводило к статистически значимому повышению экспрессии генов IL1B, IL6, CXCL8, IL12A и IL23, при этом ЭК коронарной артерии характеризовались более выраженным ответом на воздействие КФБ на уровне транскриптов в сравнении с ЭК внутренней грудной артерии. Хотя воздействие ИКФБ в большинстве случаев приводило к более выраженному увеличению экспрессии генов цитокинов в сравнении с СКФБ, на уровне белков эта зависимость от формы бионов не наблюдалась. Экспозиция СКФБ и ИКФБ приводила к повышению выделения ИЛ-6 обоими типами артериальных ЭК, в то время как повышенная секреция ИЛ-8 наблюдалась лишь при экспозиции ИКФБ ЭК внутренней грудной артерии. Заключение. Добавление КФБ к культурам первичных артериальных ЭК способствует выделению этими клетками провоспалительных цитокинов ИЛ-6 и ИЛ-8 в результате повышения экспрессии генов (IL6 и CXCL8 соответственно) независимо от формы КФБ (сферической или игольчатой). Background. Calcium phosphate bions are formed under blood supersaturation with calcium and phosphate. Circulating bions provoke endothelial injury via lysosome-dependent cell death accompanied by release of proinflammatory cytokines into the microenvironment. Aim. To evaluate the cytokine secretion profile of human primary arterial endothelial cells (ECs) exposed to either spherical (CPB-S) or needle-shaped (CPB-N) calcium phosphate bions. Materials and Methods. CPB-S and CPB-N were added at equal concentrations (100 µL, optical density 0.08-0.10, at 650 nm wavelength) to confluent cultures of primary coronary artery (HCAEC) and internal thoracic artery (HITAEC) endothelial cells in 6-well plates. At 24 h of culture, the cell culture supernatant was collected, and respective cytokines (IL-1β, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, IL-23, tumor necrosis factor-α, and γ-interferon) were measured by an enzyme-linked immunosorbent assay. Expression of cytokine (IL1B, IL6, CXCL8, IL10, IL12A, IL12B, IL23, TNF, IFNG) and cytokine receptor genes (IL1R1, IL1R2, TNFRSF1A, TNFRSF1B) was quantified with the reverse transcription-polymerase chain reaction. Results. Exposure to both CPB-S and CPB-N led to statistically significant increases in the expression of IL1B, IL6, CXCL8, IL12A, and IL23 genes. HCAEC were characterized by a greater response to CPB at the transcript level compared to HITAEC. Although CPB-N induced a more pronounced cytokine response than CPB-S, such shape-dependent effects were negligible at the protein level. The exposure to CPB-S and CPB-N resulted in elevated release of interleukin-6 by both types of arterial ECs while the interleukin-8 release was augmented exclusively in response to the CPB-N exposure of HITAEC. Conclusion. Exposure of primary arterial ECs to CPB induced the release of IL-6 and IL-8 due to the expression of respective genes regardless of the CPB shape (spherical or needle-shaped).

Inhibition of Pro-Inflammatory Cytokine Secretion by Select Antioxidants in Human Coronary Artery Endothelial Cells

2020 ◽  
Vol 90 (1-2) ◽  
pp. 103-112 ◽  
Author(s):  
Michael J. Haas ◽  
Marilu Jurado-Flores ◽  
Ramadan Hammoud ◽  
Victoria Feng ◽  
Krista Gonzales ◽  
...  
Keyword(s):  
Endothelial Cells ◽  
Ascorbic Acid ◽  
Coronary Artery ◽  
Inflammatory Cytokines ◽  
Inflammatory Cytokine ◽  
Culture Media ◽  
Cytokine Secretion ◽  
Human Coronary Artery ◽  
Tnf Α ◽  
Pro Inflammatory Cytokines

Abstract. Inflammatory and oxidative stress in endothelial cells are implicated in the pathogenesis of premature atherosclerosis in diabetes. To determine whether high-dextrose concentrations induce the expression of pro-inflammatory cytokines, human coronary artery endothelial cells (HCAEC) were exposed to either 5.5 or 27.5 mM dextrose for 24-hours and interleukin-1β (IL-1β), interleukin-2 (IL-2), interleukin-6 (IL-6), interleukin-8 (IL-8), and tumor necrosis factor α (TNF α) levels were measured by enzyme immunoassays. To determine the effect of antioxidants on inflammatory cytokine secretion, cells were also treated with α-tocopherol, ascorbic acid, and the glutathione peroxidase mimetic ebselen. Only the concentration of IL-1β in culture media from cells exposed to 27.5 mM dextrose increased relative to cells maintained in 5.5 mM dextrose. Treatment with α-tocopherol (10, 100, and 1,000 μM) and ascorbic acid (15, 150, and 1,500 μM) at the same time that the dextrose was added reduced IL-1β, IL-6, and IL-8 levels in culture media from cells maintained at 5.5 mM dextrose but had no effect on IL-1β, IL-6, and IL-8 levels in cells exposed to 27.5 mM dextrose. However, ebselen treatment reduced IL-1β, IL-6, and IL-8 levels in cells maintained in either 5.5 or 27.5 mM dextrose. IL-2 and TNF α concentrations in culture media were below the limit of detection under all experimental conditions studied suggesting that these cells may not synthesize detectable quantities of these cytokines. These results suggest that dextrose at certain concentrations may increase IL-1β levels and that antioxidants have differential effects on suppressing the secretion of pro-inflammatory cytokines in HCAEC.

Culture of Arterial Endothelial Cells

1975 ◽  
Vol 34 (03) ◽  
pp. 825-839 ◽  
Author(s):  
Francois M Booyse ◽  
Bonnie J Sedlak ◽  
Max E Rafelson
Keyword(s):  
Endothelial Cells ◽  
Calf Serum ◽  
Intercellular Junctions ◽  
Cell Number ◽  
Population Doubling ◽  
Homogeneous Population ◽  
Bovine Endothelial Cells ◽  
Pinocytotic Vesicles ◽  
Arterial Endothelial Cells ◽  
Doubling Times

SummaryArterial endothelial cells were obtained from bovine aortae by mild treatment with collagenase and medium perfusion. These cells were cultured in RPMI-1640 medium containing 15 mM Hepes buffer and 35% fetal calf serum at pH 7.35. Essentially ah (90–95%) the effluent cells were viable and 80% of these cells attached to the substratum within 1 hour. Small patches of attached cells coalesced to form confluent monolayers in 3–5 days. Confluent monolayers of endothelial cells consisted of a homogeneous population of tightly packed, polygonal cells. Selected cultures were serially subcultured (trypsin-EDTA) for 12–14 months (30–35 passages) without any apparent change in morphology or loss of growth characteristics. Primary and three-month old (15 passages) cultures had population doubling times of 32–34 hours and 29–31 hours, respectively. These cells (primary and subcultures) did not require a minimum cell number to become established in culture. Bovine endothelial cells (primary, first, fifth and thirteenth passages) were characterized ultrastructurally by the presence of Weibel-Palade bodies, pinocytotic vesicles and microfilaments and immunologically by the presence of thrombosthenin-like contractile proteins and Factor VIII antigen. The intercellular junctions of post-confluent cultures stained specifically with silver nitrate. From these data, we concluded that identifiable endothelial cells could be obtained from bovine aortae and cultured and maintained for prolonged periods of time.

Sign in / Sign up

Export Citation Format

Share Document