scholarly journals Polymerase chain reaction-based discrimination of viable from non-viable Mycoplasma gallisepticum

2014 ◽  
Vol 81 (1) ◽  
Author(s):  
Ching Giap Tan ◽  
Aini Ideris ◽  
Abdul R. Omar ◽  
Chen Pei Yii ◽  
Stanley H. Kleven
Keyword(s):  
Polymerase Chain Reaction ◽  
16S Rrna ◽  
Mycoplasma Gallisepticum ◽  
Rt Pcr ◽  
Chain Reaction ◽  
In Ovo ◽  
Experimental Conditions ◽  
Polymerase Chain

The present study was based on the reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) of the 16S ribosomal nucleic acid (rRNA) of Mycoplasma for detection of viable Mycoplasma gallisepticum. To determine the stability of M. gallisepticum 16S rRNA in vitro, three inactivation methods were used and the suspensions were stored at different temperatures. The 16S rRNA of M. gallisepticum was detected up to approximately 20–25 h at 37 °C, 22–25 h at 16 °C, and 23–27 h at 4 °C. The test, therefore, could detect viable or recently dead M. gallisepticum (< 20 h). The RT-PCR method was applied during an in vivo study of drug efficacy under experimental conditions, where commercial broiler-breeder eggs were inoculated with M. gallisepticum into the yolk. Hatched chicks that had been inoculated in ovo were treated with Macrolide 1. The method was then applied in a flock of day 0 chicks with naturally acquired vertical transmission of M. gallisepticum, treated with Macrolide 2. Swabs of the respiratory tract were obtained for PCR and RT-PCR evaluations to determine the viability of M. gallisepticum. This study proved that the combination of both PCR and RT-PCR enables detection and differentiation of viable from non-viable M. gallisepticum.

scholarly journals Διερεύνηση του ρόλου των αδρενεργικών και ντοπαμινεργικών συστημάτων στη ρύθμιση των κυτοχρωμάτων CYP3A1/2, CYP2C11 και CYP2D1/2

2012 ◽  
Author(s):  
Ευάγγελος-Παναγιώτης Δασκαλόπουλος
Keyword(s):  
Polymerase Chain Reaction ◽  
Real Time ◽  
Rt Pcr ◽  
Chain Reaction ◽  
Polymerase Chain

Τα ηπατικά κυτοχρώματα CYPs (P450s) είναι μια μεγάλη υπερ-οικογένεια πρωτεϊνών, οι οποίες εντοπίζονται σε όλους τους ζωντανούς οργανισμούς. Η σημασία τους είναι τεράστια, αφού μεταβολίζουν μια τεράστια ποικιλία ενδογενών ουσιών αλλά και ξενοβιοτικών. Οι πιο σημαντικές υποοικογένειες κυτοχρωμάτων CYP είναι η CYP3A, η CYP2C και η CYP2D, εξαιτίας του ρόλου τους στο μεταβολισμό της πλειονότητας των πιο συχνά συνταγογραφούμενων φαρμάκων. Η γνώση όσον αφορά τους παράγοντες, που μπορούν να προκαλέσουν επαγωγή ή αναστολή των κυτοχρωμάτων CYP είναι εξαιρετικής σημασίας, αφού κάθε μεταβολή στην έκφραση και την δραστικότητά τους μπορεί να έχει σοβαρότατες συνέπειες στην αποτελεσματικότητα της φαρμακευτικής αγωγής αλλά και στην φαρμακοτοξικότητα. Η αναστολή των ηπατικών CYPs μπορεί να οδηγήσει σε αυξημένα επίπεδα ενός φαρμάκου-υποστρώματος στο πλάσμα και στην ανάπτυξη τοξικών εκδηλώσεων. Αντίθετα, η επαγωγή των CYPs μπορεί να οδηγήσει σε μειωμένη αποτελεσματικότητα ή ακόμη και πλήρη αποτυχία της φαρμακοθεραπείας. Σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν η διερεύνηση στον επίμυ της επίδρασης του στρες στη ρύθμιση της έκφρασης των πιο σημαντικών για τον μεταβολισμό φαρμάκων κυτοχρωμάτων, των CYP3A, CYP2C και CYP2D. Επίσης, διερευνήθηκε ο ρόλος των αδρενεργικών υποδοχέων, των γλυκοκορτικοειδών καθώς και των μονοπατιών μεταγωγής σήματος (cAMP/PKA, JNK, GH/STAT5b) στη ρύθμιση των ανωτέρω κυτοχρωμάτων. Μελετήθηκε επίσης, ο ρόλος των D2-ντοπαμινεργικών υποδοχέων στη ρύθμιση της έκφρασης των CYP γονιδίων καθώς και η συμμετοχή του μονοπατιού μεταγωγής σήματος PI3K/Akt/FoxO1, αλλά και του μεταγραφικού παράγοντα STAT5b. Για την ερευνητική προσέγγιση αυτών των θεμάτων, έγιναν τόσο in vivo πειράματα με ενήλικες αρσενικούς επίμυες, όσο και in vitro πειράματα με καλλιέργειες πρωτογενών ηπατοκυττάρων, που απομονώθηκαν από το ήπαρ επιμύων. Οι μέθοδοι, οι οποίες χρησιμοποιήθηκαν συμπεριλαμβάνουν την Υγρή Χρωματογραφία Υψηλής Απόδοσης (HPLC) για την μέτρηση την ενζυμικής δραστικότητας των υπό μελέτην CYP3A, CYP2C και CYP2D, την ανοσοαποτύπωση κατά Western για την εκτίμηση των μεταβολών σε επίπεδο αποπρωτεΐνης, καθώς και την μέθοδο real-time polymerase chain reaction (RT-PCR, q-PCR) για την ποσοτική εκτίμηση των επιπέδων mRNA των ανωτέρω CYP γονιδίων. Τα αποτελέσματα αυτής της μελέτης κατέδειξαν ότι το ψυχολογικό στρες είναι ένας παράγοντας τεράστιας σημασίας για τη ρύθμιση της έκφρασης των CYPs. Πιο συγκεκριμένα, το στρες της μητρικής αποστέρησης, στο οποίο εκτέθηκαν οι επίμυες σε πολύ μικρή ηλικία προκάλεσε την αύξηση της έκφρασης των CYP3A1/2 και CYP2C11, ενώ το CYP2D δεν επηρεάστηκε σημαντικά. Αντιθέτως, το στρες περιορισμού προκάλεσε σημαντικές μεταβολές στην έκφραση του CYP3A2, του CYP2D και μικρότερες μεταβολές στο CYP2A. Επιπροσθέτως, επιβεβαιώθηκε η επαγωγική δράση των γλυκοκορτικοειδών στο CYP3A και η κατασταλτική τους δράση στο CYP2C. Σημαντικά ευρήματα μετά από in vivo και in vitro πειράματα, τα οποία επικεντρώθηκαν στη μελέτη των αδρενεργικών μονοπατιών φανέρωσαν ότι τα μονοπάτια cAMP/PKA, JNK και του άξονα GH/STAT5b διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στον έλεγχο της ρύθμισης της έκφρασης των CYPs. Η συμμετοχή των πυρηνικών υποδοχέων PXR, RXR και HNF4α φαίνεται να είναι σημαντική στις μεταβολές που παρατηρήθηκαν στην έκφραση αυτών των CYPs. Eπιπλέον, η αναστολή των D2-ντοπαμινεργικών υποδοχέων in vivo, οδήγησε σε μεγάλη καταστολή των CYP3A, CYP2C και CYP2D. Αντιθέτως, αναστολή των ηπατικών D2-υποδοχέων in vitro, οδήγησε σε επαγωγή αυτών των CYPs. Αυτό το εύρημα οδήγησε στην υπόθεση ότι η ινσουλίνη πιθανόν διαδραματίζει στρατηγικής σημασίας ρόλο στον έλεγχο της ρύθμισης της έκφρασης των CYPs, αφού αποδείχθηκε ότι η αναστολή in vivο των D2-υποδοχέων ενεργοποιεί το ινσουλινοεξαρτώμενο μονοπάτι PI3K/Akt, ενώ περαιτέρω έρευνες έδειξαν τον FoxO1 ως τελικό μεταγραφικό παράγοντα ρύθμισης. Παράλληλα, ο άξονας GH/STAT5b φαίνεται να παίζει επίσης πολύ σημαντικό ρυθμιστικό ρόλο και στην περίπτωση των D2-ντοπαμινεργικών μονοπατιών. Συμπερασματικά, η μελέτη αυτή έδειξε ότι το στρες, τα γλυκοκορτικοειδή και αγωνιστές αδρενεργικών υποδοχέων αποτελούν παράγοντες, που πρέπει πάντα να λαμβάνονται υπόψιν πριν τη συνταγογράφηση σε ασθενείς. Επιπλέον, η μελέτη αυτή κατέδειξε για πρώτη φορά την επίδραση των παγκρεατικών D2-ντοπαμινεργικών υποδοχέων και του μονοπατιού PI3K/Akt/FoxO1 στη ρύθμιση της έκφρασης των CYP3A, CYP2C και CYP2D. Διαπιστώθηκε επίσης, η συμμετοχή της GH, της PRL και των θυρεοειδικών ορμονών στις μεταβολές που προκάλεσαν οι φαρμακολογικοί χειρισμοί των D2-ντοπαμινεργικών υποδοχέων.

scholarly journals Cytokine-Facilitated Transduction Leads to Low-Level Engraftment in Nonablated Hosts

Blood ◽  
1997 ◽  
Vol 90 (2) ◽  
pp. 865-872 ◽  
Author(s):  
Ellen L.W. Kittler ◽  
Stefan O. Peters ◽  
Rowena B. Crittenden ◽  
Michelle E. Debatis ◽  
Hayley S. Ramshaw ◽  
...  
Keyword(s):  
Bone Marrow ◽  
Polymerase Chain Reaction ◽  
Bone Marrow Cells ◽  
Mdr1 Gene ◽  
Rt Pcr ◽  
Chain Reaction ◽  
Donor Cells ◽  
Polymerase Chain ◽  
Marrow Cells

Using a murine bone marrow transplantation model, we evaluated the long-term engraftment of retrovirally transduced bone marrow cells in nonmyeloablated hosts. Male bone marrow was stimulated in a cocktail of interleukin-3 (IL-3), IL-6, IL-11, and stem cell factor (SCF ) for 48 hours, then cocultured on the retroviral producer line MDR18.1 for an additional 24 hours. Functional transduction of hematopoietic progenitors was detected in vitro by reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR) amplification of multiple drug resistance 1 (MDR1) mRNA from high proliferative potential-colony forming cell (HPP-CFC) colonies. After retroviral transduction, male bone marrow cells were injected into nonablated female mice. Transplant recipients received three TAXOL (Bristol-Myers, Princeton, NJ) injections (10 mg/kg) over a 14-month period. Transplant recipient tissues were analyzed by Southern blot and fluorescence in situ hybridization for Y-chromosome–specific sequences and showed donor cell engraftment of approximately 9%. However, polymerase chain reaction amplification of DNAs from bone marrow, spleen, and peripheral blood showed no evidence of the transduced MDR1 gene. RT-PCR analysis of total bone marrow RNA showed that transcripts from the MDR1 gene were present in a fraction of the engrafted donor cells. These data show functional transfer of the MDR1 gene into nonmyeloablated murine hosts. However, the high rates of in vitro transduction into HPP-CFC, coupled with the low in vivo engraftment rate of donor cells containing the MDR1 gene, suggest that the majority of stem cells that incorporated the retroviral construct did not stably engraft in the host. Based on additional studies that indicate that ex vivo culture of bone marrow induces an engraftment defect concomitantly with progression of cells through S phase, we propose that the cell cycle transit required for proviral integration reduces or impairs the ability of transduced cells to stably engraft.

scholarly journals In vivo and in vitro regulation of erythropoietin mRNA: measurement by competitive polymerase chain reaction

Blood ◽  
1993 ◽  
Vol 81 (3) ◽  
pp. 617-623 ◽  
Author(s):  
J Fandrey ◽  
HF Bunn
Keyword(s):  
Polymerase Chain Reaction ◽  
Hepatoma Cell ◽  
Hepatoma Cell Line ◽  
Mrna Levels ◽  
Chain Reaction ◽  
Human Hepatoma Cell ◽  
Competitive Polymerase Chain Reaction ◽  
Polymerase Chain

Abstract The regulation of erythropoietin (Epo) production was investigated by competitive polymerase chain reaction, a highly sensitive and accurate means of measuring Epo mRNA levels. Co-amplification of the test sample with added mutant Epo cDNA template corrects for variability in the efficiency of amplification. Epo mRNA levels were determined in tissues of normal rats and in animals with varying degrees of anemia. Reduction of the hematocrit level from 0.40 to 0.15–0.20 resulted in a 300-fold increase in kidney Epo mRNA, which comprised 80% of the total Epo mRNA versus 20% from the liver. In contrast, very low levels detected in lung and spleen were not significantly increased by anemia. The human hepatoma cell line, Hep3B, secretes high levels of Epo in response to hypoxia. This regulation is, to a large extent, transcriptional. When Hep3B cells were incubated in the presence of decreasing O2 tension from 160 to 7 mm Hg, there was a monotonic increase in Epo mRNA to 50 to 100 times the normoxic level. Hyperoxia did not suppress basal expression. When cells were incubated at a PO2 of 7 mm Hg, induction of Epo mRNA was first noted at 30 minutes and was maximal at 5 to 6 hours. After Epo mRNA was boosted by a 4-hour hypoxic incubation, cells were then exposed to normoxia, which shut off further transcription of the Epo gene. The decay of Epo mRNA levels closely followed first order kinetics with a half-life of 2 hours, an effective measurement of message stability.

scholarly journals Cytokine-Facilitated Transduction Leads to Low-Level Engraftment in Nonablated Hosts

Blood ◽  
1997 ◽  
Vol 90 (2) ◽  
pp. 865-872 ◽  
Author(s):  
Ellen L.W. Kittler ◽  
Stefan O. Peters ◽  
Rowena B. Crittenden ◽  
Michelle E. Debatis ◽  
Hayley S. Ramshaw ◽  
...  
Keyword(s):  
Bone Marrow ◽  
Polymerase Chain Reaction ◽  
Bone Marrow Cells ◽  
Mdr1 Gene ◽  
Rt Pcr ◽  
Chain Reaction ◽  
Donor Cells ◽  
Polymerase Chain ◽  
Marrow Cells

Abstract Using a murine bone marrow transplantation model, we evaluated the long-term engraftment of retrovirally transduced bone marrow cells in nonmyeloablated hosts. Male bone marrow was stimulated in a cocktail of interleukin-3 (IL-3), IL-6, IL-11, and stem cell factor (SCF ) for 48 hours, then cocultured on the retroviral producer line MDR18.1 for an additional 24 hours. Functional transduction of hematopoietic progenitors was detected in vitro by reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR) amplification of multiple drug resistance 1 (MDR1) mRNA from high proliferative potential-colony forming cell (HPP-CFC) colonies. After retroviral transduction, male bone marrow cells were injected into nonablated female mice. Transplant recipients received three TAXOL (Bristol-Myers, Princeton, NJ) injections (10 mg/kg) over a 14-month period. Transplant recipient tissues were analyzed by Southern blot and fluorescence in situ hybridization for Y-chromosome–specific sequences and showed donor cell engraftment of approximately 9%. However, polymerase chain reaction amplification of DNAs from bone marrow, spleen, and peripheral blood showed no evidence of the transduced MDR1 gene. RT-PCR analysis of total bone marrow RNA showed that transcripts from the MDR1 gene were present in a fraction of the engrafted donor cells. These data show functional transfer of the MDR1 gene into nonmyeloablated murine hosts. However, the high rates of in vitro transduction into HPP-CFC, coupled with the low in vivo engraftment rate of donor cells containing the MDR1 gene, suggest that the majority of stem cells that incorporated the retroviral construct did not stably engraft in the host. Based on additional studies that indicate that ex vivo culture of bone marrow induces an engraftment defect concomitantly with progression of cells through S phase, we propose that the cell cycle transit required for proviral integration reduces or impairs the ability of transduced cells to stably engraft.

scholarly journals Amplifikasi In Vitro dan In Vivo Fragmen 0,4 KB D-Loop mtDNA Sampel Forensik

2006 ◽  
Vol 9 (2) ◽  
pp. 25-29
Author(s):  
Mukhammad Asy’ari ◽  
A. Saifuddin Noer
Keyword(s):  
Polymerase Chain Reaction ◽  
Chain Reaction ◽  
D Loop ◽  
Polymerase Chain

Daerah DNA mitokondria (mtDNA) manusia yang mempunyai tingkat polimorfisme tertinggi adalah D-loop. Urutan nukleotida D-loop mtDNA dapat dijadikan alat untuk menentukan identitas genetik seseorang. Saat ini aplikasinya banyak digunakan untuk memecahkan kasus-kasus di bidang forensik. Isolasi fragmen 0,4 kilobasa (kb) D-loop mtDNA dapat dilakukan dengan mengekstrak mtDNA dari dalam sel, kemudian menggandakan (amplifikasi) mtDNA secara in vitro dengan metoda Polymerase Chain Reaction (PCR) dan secara in vivo dengan metoda Kloning. Pada penelitian ini telah berhasil diamplifikasi secara in vitro fragmen 0,4 kb mtDNA sampel forensik dengan metoda PCR menggunakan primer M1 (5’CACCATTAGCACCCAAAGCT-3’) dan M2 (5’GATTTCAC GGAGGATGGTG-3’) dan secara in vivo dengan metoda kloning menggunakan vektor pGEM-T dalam sel inang Eschericia coli JM 109. Identifikasi hasil PCR dilakukan dengan metoda elektroforesis gel agarosa 1% menggunakan pewarna fluorisen Etidium Bromida. Sedangkan sel rekombinan hasil kloning diseleksi menggunakan media selektif mengandung antibiotik ampisilin dan zat pewarna kultur rekombinan yaitu X-gal dan IPTG sebagai indusernya. Identifikasi plasmid rekombinan yang mengandung fragmen 0,4 kb D-loop mtDNA dilakukan menggunakan enzim restriksi Pst I. Hasil kloning diperoleh jumlah koloni putih (sel rekombinan) : biru (sel non rekombinan) adalah 2 : 1. Hasil analisis restriksi enzim PstI pada plasmid rekombinan diperoleh fragmen berukuran 3,4 kb, hal ini menunjukkan bahwa DNA insert berukuran 0,4 kb sesuai dengan fragmen mtDNA hasil PCR. Plasmid rekombinan selanjutnya digunakan pada penelitian berikutnya, yaitu penentuan urutan nukleotida dengan metode sekuensing sehingga dapat diketahui identitas genetika dari sampel forensik yang dianalisis.

Effect of maturation on the expression of aquaporin 3 in mouse oocyte

Zygote ◽  
2010 ◽  
Vol 19 (1) ◽  
pp. 9-14 ◽  
Author(s):  
Jun Woo Jo ◽  
Byung Chul Jee ◽  
Chang Suk Suh ◽  
Seok Hyun Kim ◽  
Young Min Choi ◽  
...  
Keyword(s):  
Polymerase Chain Reaction ◽  
Maturation Process ◽  
Chain Reaction ◽  
Aquaporin 3 ◽  
Immature Oocytes ◽  
Antral Follicles ◽  
Polymerase Chain ◽  
Experimental Group

SummaryThis study aimed to investigate whether aquaporin 3 (Aqp3) mRNAs are expressed in immature oocytes and altered during in vitro maturation process. Five- to 6-week-old female ICR mice were primed by gonadotropin for 24 and 48 h. Immature oocytes obtained 48 h after priming were also matured in vitro for 17 to 18 h. In vivo matured oocytes were obtained after 48 h priming followed by hCG injection. Total RNAs were extracted from 80 to 150 oocytes in each experimental group, and the levels of Aqp3 mRNA were quantified by real-time reverse transcriptase polymerase chain reaction. The experiments were repeated twice using different oocytes. The Aqp3 mRNA was expressed in immature oocytes, as well as in in vitro and in vivo matured oocytes. The expression level was higher in immature oocytes obtained 48 h after priming (17.2 ± 8.6, mean ± SD) than those with no priming (5.7 ± 0.8) or obtained 24 h after priming (2.5 ± 0.8). The expression of Aqp3 mRNA decreased after in vitro maturation (1.2 ± 0.5), which was similar to in vivo matured oocytes (1.0 ± 0.0). Our work demonstrated that Aqp3 mRNA expression increased during the development of immature oocyte but decreased after completion of in vitro maturation. The results indicate that AQP3 is certainly needed for the acquisition of immature oocytes’ full growing potential within antral follicles.

Detection of Toxoplasma gondii in 94 placentae from infected women by polymerase chain reaction, in vivo, and in vitro cultures

Placenta ◽  
1998 ◽  
Vol 19 (7) ◽  
pp. 545-549 ◽  
Author(s):  
H. Fricker-Hidalgo ◽  
H. Pelloux ◽  
C. Racinet ◽  
I. Grefenstette ◽  
C. Bost-Bru ◽  
...  
Keyword(s):  
Polymerase Chain Reaction ◽  
Toxoplasma Gondii ◽  
In Vitro Cultures ◽  
Chain Reaction ◽  
Polymerase Chain

scholarly journals Downregulation of Caspase-2 Expression in Somitic Cells following Coculture with Chicken Notochord

2013 ◽  
Vol 2013 ◽  
pp. 1-8 ◽  
Author(s):  
Rezgar Rahbari ◽  
Mohammad Mazani ◽  
Mohammad Ghasem Golmohammadi ◽  
Mohsen Sagha
Keyword(s):  
Polymerase Chain Reaction ◽  
Enzyme Activity ◽  
Cell Survival ◽  
Neural Tube ◽  
Chain Reaction ◽  
Survival Assay ◽  
Polymerase Chain ◽  
Caspase 2

Somites are spherical aggregations of mesodermal cells located on either sides of neural tube and are differentiated into sclerotome and dermomyotome. Notochord as an axial mesoderm has a major role in somitic cell survival and differentiation in vivo. Despite secreting the survival factors, how to notochord inhibits somitic cells apoptosis remains to be elusive. So, this study was aimed to investigate downregulation of caspase-2 expression in somitic cells upon coculturing with notochord. By using alginate system to encapsulate the isolated notochord in Somite + Notochord group, the embryonic somites were cocultured with the notochord on different days. Concurrently in somite group, the somites were cultured alone. Survival assay with MTT showed that the rate of viability in somitic cells cocultured with notochord increased from 59% on day 2 to 89.7% on day 6 but decreased to 38.5% on day 10 after coculturing. Reverse transcriptase-polymerase chain reaction and spectrophotometry analysis also confirmed these findings and showed low caspase-2 and high Bcl-2 expressions and low caspase-2 enzyme activity in somitic cells cocultured with notochord, respectively. These results clearly show that the notochord enhances survival of somitic cells in vitro through downregulating of caspase-2 expression along with triggering differentiation of somitic cells to Pax-1 expressing mesenchymal cells.

Sign in / Sign up

Export Citation Format

Share Document