scholarly journals Downregulation of Caspase-2 Expression in Somitic Cells following Coculture with Chicken Notochord

2013 ◽  
Vol 2013 ◽  
pp. 1-8 ◽  
Author(s):  
Rezgar Rahbari ◽  
Mohammad Mazani ◽  
Mohammad Ghasem Golmohammadi ◽  
Mohsen Sagha
Keyword(s):  
Polymerase Chain Reaction ◽  
Enzyme Activity ◽  
Cell Survival ◽  
Neural Tube ◽  
Chain Reaction ◽  
Survival Assay ◽  
Polymerase Chain ◽  
Caspase 2

Somites are spherical aggregations of mesodermal cells located on either sides of neural tube and are differentiated into sclerotome and dermomyotome. Notochord as an axial mesoderm has a major role in somitic cell survival and differentiation in vivo. Despite secreting the survival factors, how to notochord inhibits somitic cells apoptosis remains to be elusive. So, this study was aimed to investigate downregulation of caspase-2 expression in somitic cells upon coculturing with notochord. By using alginate system to encapsulate the isolated notochord in Somite + Notochord group, the embryonic somites were cocultured with the notochord on different days. Concurrently in somite group, the somites were cultured alone. Survival assay with MTT showed that the rate of viability in somitic cells cocultured with notochord increased from 59% on day 2 to 89.7% on day 6 but decreased to 38.5% on day 10 after coculturing. Reverse transcriptase-polymerase chain reaction and spectrophotometry analysis also confirmed these findings and showed low caspase-2 and high Bcl-2 expressions and low caspase-2 enzyme activity in somitic cells cocultured with notochord, respectively. These results clearly show that the notochord enhances survival of somitic cells in vitro through downregulating of caspase-2 expression along with triggering differentiation of somitic cells to Pax-1 expressing mesenchymal cells.

scholarly journals In vivo and in vitro regulation of erythropoietin mRNA: measurement by competitive polymerase chain reaction

Blood ◽  
1993 ◽  
Vol 81 (3) ◽  
pp. 617-623 ◽  
Author(s):  
J Fandrey ◽  
HF Bunn
Keyword(s):  
Polymerase Chain Reaction ◽  
Hepatoma Cell ◽  
Hepatoma Cell Line ◽  
Mrna Levels ◽  
Chain Reaction ◽  
Human Hepatoma Cell ◽  
Competitive Polymerase Chain Reaction ◽  
Polymerase Chain

Abstract The regulation of erythropoietin (Epo) production was investigated by competitive polymerase chain reaction, a highly sensitive and accurate means of measuring Epo mRNA levels. Co-amplification of the test sample with added mutant Epo cDNA template corrects for variability in the efficiency of amplification. Epo mRNA levels were determined in tissues of normal rats and in animals with varying degrees of anemia. Reduction of the hematocrit level from 0.40 to 0.15–0.20 resulted in a 300-fold increase in kidney Epo mRNA, which comprised 80% of the total Epo mRNA versus 20% from the liver. In contrast, very low levels detected in lung and spleen were not significantly increased by anemia. The human hepatoma cell line, Hep3B, secretes high levels of Epo in response to hypoxia. This regulation is, to a large extent, transcriptional. When Hep3B cells were incubated in the presence of decreasing O2 tension from 160 to 7 mm Hg, there was a monotonic increase in Epo mRNA to 50 to 100 times the normoxic level. Hyperoxia did not suppress basal expression. When cells were incubated at a PO2 of 7 mm Hg, induction of Epo mRNA was first noted at 30 minutes and was maximal at 5 to 6 hours. After Epo mRNA was boosted by a 4-hour hypoxic incubation, cells were then exposed to normoxia, which shut off further transcription of the Epo gene. The decay of Epo mRNA levels closely followed first order kinetics with a half-life of 2 hours, an effective measurement of message stability.

scholarly journals Amplifikasi In Vitro dan In Vivo Fragmen 0,4 KB D-Loop mtDNA Sampel Forensik

2006 ◽  
Vol 9 (2) ◽  
pp. 25-29
Author(s):  
Mukhammad Asy’ari ◽  
A. Saifuddin Noer
Keyword(s):  
Polymerase Chain Reaction ◽  
Chain Reaction ◽  
D Loop ◽  
Polymerase Chain

Daerah DNA mitokondria (mtDNA) manusia yang mempunyai tingkat polimorfisme tertinggi adalah D-loop. Urutan nukleotida D-loop mtDNA dapat dijadikan alat untuk menentukan identitas genetik seseorang. Saat ini aplikasinya banyak digunakan untuk memecahkan kasus-kasus di bidang forensik. Isolasi fragmen 0,4 kilobasa (kb) D-loop mtDNA dapat dilakukan dengan mengekstrak mtDNA dari dalam sel, kemudian menggandakan (amplifikasi) mtDNA secara in vitro dengan metoda Polymerase Chain Reaction (PCR) dan secara in vivo dengan metoda Kloning. Pada penelitian ini telah berhasil diamplifikasi secara in vitro fragmen 0,4 kb mtDNA sampel forensik dengan metoda PCR menggunakan primer M1 (5’CACCATTAGCACCCAAAGCT-3’) dan M2 (5’GATTTCAC GGAGGATGGTG-3’) dan secara in vivo dengan metoda kloning menggunakan vektor pGEM-T dalam sel inang Eschericia coli JM 109. Identifikasi hasil PCR dilakukan dengan metoda elektroforesis gel agarosa 1% menggunakan pewarna fluorisen Etidium Bromida. Sedangkan sel rekombinan hasil kloning diseleksi menggunakan media selektif mengandung antibiotik ampisilin dan zat pewarna kultur rekombinan yaitu X-gal dan IPTG sebagai indusernya. Identifikasi plasmid rekombinan yang mengandung fragmen 0,4 kb D-loop mtDNA dilakukan menggunakan enzim restriksi Pst I. Hasil kloning diperoleh jumlah koloni putih (sel rekombinan) : biru (sel non rekombinan) adalah 2 : 1. Hasil analisis restriksi enzim PstI pada plasmid rekombinan diperoleh fragmen berukuran 3,4 kb, hal ini menunjukkan bahwa DNA insert berukuran 0,4 kb sesuai dengan fragmen mtDNA hasil PCR. Plasmid rekombinan selanjutnya digunakan pada penelitian berikutnya, yaitu penentuan urutan nukleotida dengan metode sekuensing sehingga dapat diketahui identitas genetika dari sampel forensik yang dianalisis.

Effect of maturation on the expression of aquaporin 3 in mouse oocyte

Zygote ◽  
2010 ◽  
Vol 19 (1) ◽  
pp. 9-14 ◽  
Author(s):  
Jun Woo Jo ◽  
Byung Chul Jee ◽  
Chang Suk Suh ◽  
Seok Hyun Kim ◽  
Young Min Choi ◽  
...  
Keyword(s):  
Polymerase Chain Reaction ◽  
Maturation Process ◽  
Chain Reaction ◽  
Aquaporin 3 ◽  
Immature Oocytes ◽  
Antral Follicles ◽  
Polymerase Chain ◽  
Experimental Group

SummaryThis study aimed to investigate whether aquaporin 3 (Aqp3) mRNAs are expressed in immature oocytes and altered during in vitro maturation process. Five- to 6-week-old female ICR mice were primed by gonadotropin for 24 and 48 h. Immature oocytes obtained 48 h after priming were also matured in vitro for 17 to 18 h. In vivo matured oocytes were obtained after 48 h priming followed by hCG injection. Total RNAs were extracted from 80 to 150 oocytes in each experimental group, and the levels of Aqp3 mRNA were quantified by real-time reverse transcriptase polymerase chain reaction. The experiments were repeated twice using different oocytes. The Aqp3 mRNA was expressed in immature oocytes, as well as in in vitro and in vivo matured oocytes. The expression level was higher in immature oocytes obtained 48 h after priming (17.2 ± 8.6, mean ± SD) than those with no priming (5.7 ± 0.8) or obtained 24 h after priming (2.5 ± 0.8). The expression of Aqp3 mRNA decreased after in vitro maturation (1.2 ± 0.5), which was similar to in vivo matured oocytes (1.0 ± 0.0). Our work demonstrated that Aqp3 mRNA expression increased during the development of immature oocyte but decreased after completion of in vitro maturation. The results indicate that AQP3 is certainly needed for the acquisition of immature oocytes’ full growing potential within antral follicles.

Detection of Toxoplasma gondii in 94 placentae from infected women by polymerase chain reaction, in vivo, and in vitro cultures

Placenta ◽  
1998 ◽  
Vol 19 (7) ◽  
pp. 545-549 ◽  
Author(s):  
H. Fricker-Hidalgo ◽  
H. Pelloux ◽  
C. Racinet ◽  
I. Grefenstette ◽  
C. Bost-Bru ◽  
...  
Keyword(s):  
Polymerase Chain Reaction ◽  
Toxoplasma Gondii ◽  
In Vitro Cultures ◽  
Chain Reaction ◽  
Polymerase Chain

scholarly journals In vivo footprinting of the human alpha-globin locus upstream regulatory element by guanine and adenine ligation-mediated polymerase chain reaction.

1992 ◽  
Vol 12 (5) ◽  
pp. 2135-2142 ◽  
Author(s):  
E C Strauss ◽  
N C Andrews ◽  
D R Higgs ◽  
S H Orkin
Keyword(s):  
Polymerase Chain Reaction ◽  
Regulatory Element ◽  
Dimethyl Sulfate ◽  
Chain Reaction ◽  
Alpha Globin ◽  
Guanine And Adenine ◽  
Polymerase Chain ◽  
In Vivo Footprinting

A major regulatory element required for expression of the human alpha-globin genes is located 40 kb upstream of the embryonic zeta-globin gene. To understand how this and other locus control region (LCR) elements contribute to high-level expression in erythroid cells, we have performed high-resolution, in vivo dimethyl sulfate footprinting. In addition, we have modified the dimethyl sulfate-based ligation-mediated polymerase chain reaction in vivo footprinting procedure to permit the assessment of interactions at guanine and adenine residues, rather than guanines alone. In vivo footprinting of the human alpha-LCR element carried on chromosome 16 in a mouse erythroleukemia cell environment revealed protein occupancy at GATA-1, AP-1/NF-E2, and CACC/GGTGG motifs, specific differences compared with in vitro protein binding, and distinct changes in one region upon dimethyl sulfoxide-induced cellular maturation. No protein contacts were detected in nonexpressing hepatoma cells. In addition, we have demonstrated that two AP-1 motifs in the alpha-LCR element which are occupied in vivo bind purified mouse NF-E2 protein in vitro. Our data suggest that three proteins, GATA-1, NF-E2, and unknown CACC/GGTGG factors, are minimally required as DNA-binding proteins for the function of LCR-like elements. The juxtaposition and interaction of these factors with each other, and with accessory proteins not directly in contact with DNA, are likely to account for the relative position independence of the upstream globin regulatory elements.

scholarly journals The knockdown of c-myc expression by RNAi inhibits cell proliferation in human colon cancer HT-29 cells in vitro and in vivo

2009 ◽  
Vol 14 (2) ◽  
Author(s):  
Xiao Zhang ◽  
Yin-Lin Ge ◽  
Run-Hua Tian
Keyword(s):  
Colon Cancer ◽  
Polymerase Chain Reaction ◽  
Reverse Transcription ◽  
Human Colon ◽  
Chain Reaction ◽  
Human Colon Cancer ◽  
Polymerase Chain ◽  
Ht 29

AbstractWe investigated the effects of RNA interference-mediated silencing of the c-myc gene on celluar proliferation and apoptosis in human colon cancer HT-29 cells in vitro and in vivo. A small interfering RNA (siRNA) targeting c-myc was designed, the DNA template was synthesized, and the siRNA was obtained by in vitro transcription. After siRNA transfection into HT-29 and human neuroblastoma IMR-32 cells with Lipofectamine 2000™, the proliferation of the HT-29 and IMR-32 cells was assessed via 3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) colorimetry, and Hoechst 33258 staining was used to observe cell apoptosis. Following gene transfer to HT-29 cells, the expression of c-myc mRNA was examined via reverse transcription polymerase chain reaction, and the level of the protein via Western blot assay. Growth curves were constructed and in vivo experiments were performed on nude mice to assess the effects of c-myc silencing on tumor growth. The c-myc expression in the tumor tissue was measured by reverse transcription polymerase chain reaction and subsequently by immunohistochemistry. Our paper demonstrates that the delivery of siRNA directed against c-myc not only efficiently down-regulated the expression of c-myc, inhibited the proliferation of HT-29 cells and induced apoptosis in vitro, but also suppressed the growth of colon cancer cells in vivo.

scholarly journals Διερεύνηση του ρόλου των αδρενεργικών και ντοπαμινεργικών συστημάτων στη ρύθμιση των κυτοχρωμάτων CYP3A1/2, CYP2C11 και CYP2D1/2

2012 ◽  
Author(s):  
Ευάγγελος-Παναγιώτης Δασκαλόπουλος
Keyword(s):  
Polymerase Chain Reaction ◽  
Real Time ◽  
Rt Pcr ◽  
Chain Reaction ◽  
Polymerase Chain

Τα ηπατικά κυτοχρώματα CYPs (P450s) είναι μια μεγάλη υπερ-οικογένεια πρωτεϊνών, οι οποίες εντοπίζονται σε όλους τους ζωντανούς οργανισμούς. Η σημασία τους είναι τεράστια, αφού μεταβολίζουν μια τεράστια ποικιλία ενδογενών ουσιών αλλά και ξενοβιοτικών. Οι πιο σημαντικές υποοικογένειες κυτοχρωμάτων CYP είναι η CYP3A, η CYP2C και η CYP2D, εξαιτίας του ρόλου τους στο μεταβολισμό της πλειονότητας των πιο συχνά συνταγογραφούμενων φαρμάκων. Η γνώση όσον αφορά τους παράγοντες, που μπορούν να προκαλέσουν επαγωγή ή αναστολή των κυτοχρωμάτων CYP είναι εξαιρετικής σημασίας, αφού κάθε μεταβολή στην έκφραση και την δραστικότητά τους μπορεί να έχει σοβαρότατες συνέπειες στην αποτελεσματικότητα της φαρμακευτικής αγωγής αλλά και στην φαρμακοτοξικότητα. Η αναστολή των ηπατικών CYPs μπορεί να οδηγήσει σε αυξημένα επίπεδα ενός φαρμάκου-υποστρώματος στο πλάσμα και στην ανάπτυξη τοξικών εκδηλώσεων. Αντίθετα, η επαγωγή των CYPs μπορεί να οδηγήσει σε μειωμένη αποτελεσματικότητα ή ακόμη και πλήρη αποτυχία της φαρμακοθεραπείας. Σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν η διερεύνηση στον επίμυ της επίδρασης του στρες στη ρύθμιση της έκφρασης των πιο σημαντικών για τον μεταβολισμό φαρμάκων κυτοχρωμάτων, των CYP3A, CYP2C και CYP2D. Επίσης, διερευνήθηκε ο ρόλος των αδρενεργικών υποδοχέων, των γλυκοκορτικοειδών καθώς και των μονοπατιών μεταγωγής σήματος (cAMP/PKA, JNK, GH/STAT5b) στη ρύθμιση των ανωτέρω κυτοχρωμάτων. Μελετήθηκε επίσης, ο ρόλος των D2-ντοπαμινεργικών υποδοχέων στη ρύθμιση της έκφρασης των CYP γονιδίων καθώς και η συμμετοχή του μονοπατιού μεταγωγής σήματος PI3K/Akt/FoxO1, αλλά και του μεταγραφικού παράγοντα STAT5b. Για την ερευνητική προσέγγιση αυτών των θεμάτων, έγιναν τόσο in vivo πειράματα με ενήλικες αρσενικούς επίμυες, όσο και in vitro πειράματα με καλλιέργειες πρωτογενών ηπατοκυττάρων, που απομονώθηκαν από το ήπαρ επιμύων. Οι μέθοδοι, οι οποίες χρησιμοποιήθηκαν συμπεριλαμβάνουν την Υγρή Χρωματογραφία Υψηλής Απόδοσης (HPLC) για την μέτρηση την ενζυμικής δραστικότητας των υπό μελέτην CYP3A, CYP2C και CYP2D, την ανοσοαποτύπωση κατά Western για την εκτίμηση των μεταβολών σε επίπεδο αποπρωτεΐνης, καθώς και την μέθοδο real-time polymerase chain reaction (RT-PCR, q-PCR) για την ποσοτική εκτίμηση των επιπέδων mRNA των ανωτέρω CYP γονιδίων. Τα αποτελέσματα αυτής της μελέτης κατέδειξαν ότι το ψυχολογικό στρες είναι ένας παράγοντας τεράστιας σημασίας για τη ρύθμιση της έκφρασης των CYPs. Πιο συγκεκριμένα, το στρες της μητρικής αποστέρησης, στο οποίο εκτέθηκαν οι επίμυες σε πολύ μικρή ηλικία προκάλεσε την αύξηση της έκφρασης των CYP3A1/2 και CYP2C11, ενώ το CYP2D δεν επηρεάστηκε σημαντικά. Αντιθέτως, το στρες περιορισμού προκάλεσε σημαντικές μεταβολές στην έκφραση του CYP3A2, του CYP2D και μικρότερες μεταβολές στο CYP2A. Επιπροσθέτως, επιβεβαιώθηκε η επαγωγική δράση των γλυκοκορτικοειδών στο CYP3A και η κατασταλτική τους δράση στο CYP2C. Σημαντικά ευρήματα μετά από in vivo και in vitro πειράματα, τα οποία επικεντρώθηκαν στη μελέτη των αδρενεργικών μονοπατιών φανέρωσαν ότι τα μονοπάτια cAMP/PKA, JNK και του άξονα GH/STAT5b διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στον έλεγχο της ρύθμισης της έκφρασης των CYPs. Η συμμετοχή των πυρηνικών υποδοχέων PXR, RXR και HNF4α φαίνεται να είναι σημαντική στις μεταβολές που παρατηρήθηκαν στην έκφραση αυτών των CYPs. Eπιπλέον, η αναστολή των D2-ντοπαμινεργικών υποδοχέων in vivo, οδήγησε σε μεγάλη καταστολή των CYP3A, CYP2C και CYP2D. Αντιθέτως, αναστολή των ηπατικών D2-υποδοχέων in vitro, οδήγησε σε επαγωγή αυτών των CYPs. Αυτό το εύρημα οδήγησε στην υπόθεση ότι η ινσουλίνη πιθανόν διαδραματίζει στρατηγικής σημασίας ρόλο στον έλεγχο της ρύθμισης της έκφρασης των CYPs, αφού αποδείχθηκε ότι η αναστολή in vivο των D2-υποδοχέων ενεργοποιεί το ινσουλινοεξαρτώμενο μονοπάτι PI3K/Akt, ενώ περαιτέρω έρευνες έδειξαν τον FoxO1 ως τελικό μεταγραφικό παράγοντα ρύθμισης. Παράλληλα, ο άξονας GH/STAT5b φαίνεται να παίζει επίσης πολύ σημαντικό ρυθμιστικό ρόλο και στην περίπτωση των D2-ντοπαμινεργικών μονοπατιών. Συμπερασματικά, η μελέτη αυτή έδειξε ότι το στρες, τα γλυκοκορτικοειδή και αγωνιστές αδρενεργικών υποδοχέων αποτελούν παράγοντες, που πρέπει πάντα να λαμβάνονται υπόψιν πριν τη συνταγογράφηση σε ασθενείς. Επιπλέον, η μελέτη αυτή κατέδειξε για πρώτη φορά την επίδραση των παγκρεατικών D2-ντοπαμινεργικών υποδοχέων και του μονοπατιού PI3K/Akt/FoxO1 στη ρύθμιση της έκφρασης των CYP3A, CYP2C και CYP2D. Διαπιστώθηκε επίσης, η συμμετοχή της GH, της PRL και των θυρεοειδικών ορμονών στις μεταβολές που προκάλεσαν οι φαρμακολογικοί χειρισμοί των D2-ντοπαμινεργικών υποδοχέων.

Sign in / Sign up

Export Citation Format

Share Document