Systematic in silico discovery of novel solute carrier-like proteins from proteomes

Solute carrier (SLC) proteins represent the largest superfamily of transmembrane transporters, the systematic analysis of which is hampered by their functional and structural heterogeneity, despite their biological importance. Based on available nomenclature systems, we suspected that many as yet unidentified SLC transporters exist in the human genome. Here, we present criteria for defining "SLC-likeness" and apply them to curate a set of "SLC-like" protein families from the Transporter Classification Database (TCDB) and Protein families (Pfam) databases. Computational sequence similarity searches then surprisingly yielded ~130 more proteins in human with SLC-like properties, compared to previous annotations. Several of these novel putative SLC transporter proteins actually have documented transport activity in the scientific literature. We complete our overview of the SLC-ome by presenting an algorithm to classify SLC-like proteins into protein families, investigating their known functions and evolutionary relationships to similar proteins from 6 other clinically relevant experimental organisms, and pinpointing structural orphans. We envision that our work will serve as a stepping stone for future studies of the biological function and the identification of the natural substrates of the many under-explored SLC transporters, as well as the development of new therapeutic applications, including strategies for personalized medicine and drug delivery.

Biallelic variants in SLC38A3 encoding a glutamine transporter cause epileptic encephalopathy

The solute carrier (SLC) superfamily encompasses >400 transmembrane transporters involved in the exchange of amino acids, nutrients, ions, metals, neurotransmitters and metabolites across biological membranes. SLCs are highly expressed in the mammalian brain; defects in nearly 100 unique SLC-encoding genes (OMIM: https://www.omim.org) are associated with rare Mendelian disorders including developmental and epileptic encephalopathy (DEE) and severe neurodevelopmental disorders (NDDs). Exome sequencing and family-based rare variant analyses on a cohort with NDD identified two siblings with DEE and a shared deleterious homozygous splicing variant in SLC38A3. The gene encodes SNAT3, a sodium-coupled neutral amino acid transporter and a principal transporter of the amino acids asparagine, histidine, and glutamine, the latter being the precursor for the neurotransmitters GABA and glutamate. Additional subjects with a similar DEE phenotype and biallelic predicted-damaging SLC38A3 variants were ascertained through GeneMatcher and collaborations with research and clinical molecular diagnostic laboratories. Untargeted metabolomic analysis was performed to identify novel metabolic biomarkers. Ten individuals from seven unrelated families from six different countries with deleterious biallelic variants in SLC38A3 were identified. Global developmental delay, intellectual disability, hypotonia, and absent speech were common features while microcephaly, epilepsy, and visual impairment were present in the majority. Epilepsy was drug-resistant in half. Metabolomic analysis revealed perturbations of glutamate, histidine, and nitrogen metabolism in plasma, urine, and cerebrospinal fluid of selected subjects, potentially representing biomarkers of disease. Our data support the contention that SLC38A3 is a novel disease gene for DEE and illuminate the likely pathophysiology of the disease as perturbations in glutamine homeostasis.

Symmetry reduction in a hyperpolarization-activated homotetrameric ion channel

Plants obtain nutrients from the soil via transmembrane transporters and channels in their root hairs, from which ions radially transport in towards the xylem for distribution across the plant body. We determined structures of the hyperpolarization-activated channel AKT1 from Arabidopsis thaliana, which mediates K+ uptake from the soil into plant roots. These structures of AtAKT1 embedded in lipid nanodiscs show that the channel undergoes a reduction of C4 to C2 symmetry, possibly to regulate its electrical activation.

A Genomic and Transcriptomic Study on the DDT-Resistant Trichoderma hamatum FBL 587: First Genetic Data into Mycoremediation Strategies for DDT-Polluted Sites

Trichoderma hamatum FBL 587 isolated from DDT-contaminated agricultural soils stands out as a remarkable strain with DDT-resistance and the ability to enhance DDT degradation process in soil. Here, whole genome sequencing and RNA-Seq studies for T. hamatum FBL 587 under exposure to DDT were performed. In the 38.9 Mb-genome of T. hamatum FBL 587, 10,944 protein-coding genes were predicted and annotated, including those of relevance to mycoremediation such as production of secondary metabolites and siderophores. The genome-scale transcriptional responses of T. hamatum FBL 587 to DDT exposure showed 1706 upregulated genes, some of which were putatively involved in the cellular translocation and degradation of DDT. With regards to DDT removal capacity, it was found upregulation of metabolizing enzymes such as P450s, and potentially of downstream DDT-transforming enzymes such as epoxide hydrolases, FAD-dependent monooxygenases, glycosyl- and glutathione-transferases. Based on transcriptional responses, the DDT degradation pathway could include transmembrane transporters of DDT, antioxidant enzymes for oxidative stress due to DDT exposure, as well as lipases and biosurfactants for the enhanced solubility of DDT. Our study provides the first genomic and transcriptomic data on T. hamatum FBL 587 under exposure to DDT, which are a base for a better understanding of mycoremediation strategies for DDT-polluted sites.

Knocking out AtCALS7 disturbs photoassimilate distribution and weakens defence against phytoplasma infection

Callose accumulation around sieve pores, under control of Callose synthase 7 (AtCALS7), has been interpreted as a mechanical response to limit pathogen spread in phytoplasma-infected plants. AtCALS7 is also involved in sieve-pore development and, hence, in mass-flow regulation, carbohydrate metabolism and distribution, and plant growth. Multiple roles of AtCALS7 during phytoplasma infection were investigated in healthy and phytoplasma-infected [Chrysanthemum Yellows (CY)-phytoplasma] wild-type and Atcals7ko Arabidopsis lines. In keeping with an increased phytoplasma titre in Atcals7ko plants, floral stalk height of infected wild-type and mutant plants was reduced by, respectively, 88 and 100% in comparison to their healthy controls, suggesting a higher investment of host resources in phytoplasma growth in the absence of AtCALS7. The apparently increased susceptibility of mutants was investigated by microscopic, metabolic and molecular analyses. Infection influenced the sieve-pore functionality in wild-type plants, which hardly affected plant growth, and plasmodesmata in the cortex, a phenomenon less prominent in mutants. Infection also increased the level of some sugars (glucose, sucrose, myoinositol), but to the highest extent in mutants. Finally, infection induced a similar upregulation of gene expression of enzymes involved in sucrose cleavage (AtSUS5, AtSUS6) in mutants and wild-type plants and an upregulation of carbohydrate transmembrane transporters (AtSWEET11, AtSTP13, AtSUC3) in mutants only. A more effective plasmodesmal closure seemingly suppressed spread of phytoplasma effectors, which rendered wild-type plants less susceptible to infection, because gene expression of enzymes channeling carbohydrates towards phytoplasmas is less promoted

Epigenomic signature of the progeroid Cockayne syndrome exposes distinct and common features with physiological ageing

Cockayne syndrome (CS) and UV-sensitivity syndrome (UVSS) are rare genetic disorders caused by mutation of the DNA repair and chromatin remodelling proteins CSA or CSB, but only CS patients display a progeroid and neurodegenerative phenotype. As epigenetic modifications constitute a well-established hallmark of ageing, we characterized genome-wide DNA methylation (DNAm) of fibroblasts from CS versus UVSS patients and healthy donors. The analysis of differentially methylated positions and regions revealed a CS-specific epigenetic signature, enriched in developmental transcription factors, transmembrane transporters, and cell adhesion factors. The CS-specific signature compared to DNAm changes in other progeroid diseases and regular ageing, identifyied commonalities and differences in epigenetic remodelling. CS shares DNAm changes with normal ageing more than other progeroid diseases do, and according to the methylation clock CS samples show up to 13-fold accelerated ageing. Thus, CS is characterized by a specific epigenomic signature that partially overlaps with and exacerbates DNAm changes occurring in physiological aging. Our results unveil new genes and pathways that are potentially relevant for the progeroid/degenerative CS phenotype.

Structure-function relationships in transmembrane transporters

Οι μεταφορείς είναι διαμεμβρανικές πρωτεΐνες που πραγματοποιούν την επιλεκτική μεταφορά ουσιών μέσω των μεμβρανών. Τα μέλη της οικογένειας μεταφορέων NAT (Nucleobase Ascorbate Transporter family) είναι συμμεταφορείς H+ ή Na+ ειδικοί για την πρόσληψη είτε πουρινών και πυριμιδινών είτε L-ασκορβικού οξέος [1]. Παρά το γεγονός ότι αρκετά μέλη έχουν μελετηθεί εκτενώς σε γενετικό, βιοχημικό και κυτταρικό επίπεδο και οι δομές μελών από το βακτήριο Escherichia coli and τον μύκητα Aspergillus nidulans έχουν δημοσιευθεί παρέχοντας μια πληθώρα δεδομένων για τον μηχανισμό λειτουργίας, τα υπάρχοντα δεδομένα δεν είναι ικανά να εξηγήσουν πλήρως το πως καθορίζεται η εκλεκτικότητα των υποστρωμάτων [2,3]. Καλά χαρακτηρισμένα μέλη από τα βακτήρια, τους μύκητες και τα φυτά μεταφέρουν ειδικά πουρίνες η/και πυριμιδίνες ενώ τα θηλαστικά και άλλα σπονδυλωτά διαθέτουν μέλη που είναι ειδικά για L-ασκορβικό οξύ (SVCT1/2) αλλά και μέλη ειδικά για νουκλεοτιδικές βάσεις (π.χ. rSNBT1) [4,5]. Τα σπονδυλωτά διαθέτουν ένα επιπλέον παράλογο άγνωστης λειτουργιας (SVCT3) [5].Οι δομές από δυο μέλη της NAT οικογένειας είναι γνωστές [2,3,6]. Αυτές είναι η δομή του μεταφορέα ουρακίλης της E.coli UraA και του μεταφορέα ουρικού οξέος-ξανθίνης του A. nidulans UapA. Και οι δυο πρωτεΐνες αποτελούνται από 14 διαμεμβρανικά τμήματα που χαρακτηρίζονται από δύο ανεστραμμένες επαναλήψεις (7+7) που αντιστοιχούν σε δύο επικράτειες, την επικράτεια πυρήνα (core domain) και την επικράτεια διμερισμού (dimerization domain). Και οι δύο πρωτεΐνες σχηματίζουν διμερή, ο σχηματισμός των οποίων είναι απαραίτητος για την λειτουργία των μεταφορέων. Ο UapA είναι ένας συμμεταφορέας ουρικού οξέος-ξανθίνης/H+ του μύκητα A. nidulans και θεωρείται το πρότυπο, ευκαρυωτικό μέλος αυτής της οικογένειας επειδή είναι ένας από τους πιο εκτενώς χαρακτηρισμένους ευκαρυωτικούς μεταφορείς σε ότι αφορά τις σχέσεις-δομής λειτουργίας, την εκλεκτικότητα υποστρώματος, την ρύθμιση της έκφρασης και την υποκυτταρική διακίνηση [7]. Όλοι οι ΝΑΤ μεταφορείς περιέχουν ένα συντηρημένο μοτίβο στο 10ο διαμεμβρανικό τμήμα που ονομάστηκε ιστορικά σαν αλληλουχία-αναγνώρισης ΝΑΤ (NAT signature motif) το οποίο περιλαμβάνει κατάλοιπα που είναι απαραίτητα για την δέσμευση υποστρώματος και την εκλεκτικότητα ή για την κατάλυση της μεταφοράς [1,8]. Προηγούμενες μελέτες στον UapA έδειξαν ότι οι περισσότερες μεταλλαγές που επηρεάζουν την εκλεκτικότητα του, που έχουν προκύψει από τυχαίες μεταλλαξιγενέσεις, βρίσκονται εκτός της θέσης δέσμευσης υποστρώματος και της αλληλουχίας-μοτίβου ΝΑΤ [9–11]. Από αυτές οι πιο γνωστές μεταλλαγές αφορούν τα κατάλοιπα Arg481, Thr526 και Phe528 που εντοπίζονται κατά μήκος της πορείας κύλισης της επικράτειας πυρήνα πάνω στο διμερές. Επιπλέον, πρόσφατες μελέτες έδειξαν ότι συγκεκριμένες αληλλεπιδράσεις του UapA με μεμβρανικά λιπίδια στην επιφάνεια διμερισμού είναι απαραίτητες για τον σχηματισμό ή/και την σταθερότητα των λειτουργικών διμερών [12]. Πιο συγκεκριμένα, κατά την διαδικασία απομόνωσης του UapA συγκατακρημνίζονται και λιπίδια και η απομάκρυνση αυτών των λιπιδίων οδηγεί σε διάλυση του διμερούς συμπλόκου σε μονομερή. Προσθήκη φωσφο-ινοσιτιδίων (PIs) ή φωσφατιδυλοαιθανολαμίνης (PEs) οδήγησε στον επανασχηματισμό του διμερούς. Προσομοιώσεις μοριακής δυναμικής (MDs) προέβλεψαν την ύπαρξη μιας ειδικής θέσης δέσμευσης λιπιδίων στην επιφάνεια διμερισμού που αποτελείται από τρία κατάλοιπα αργινίνης Arg287, Arg478 και Arg479. Η αντικατάσταση αυτών των καταλοίπων οδήγησε σε πλήρη απώλεια λειτουργίας η οποία οφείλεται στην απώλεια σχηματισμού του λειτουργικού διμερούς σε μεγάλο ποσοστό της πρωτεΐνης όπως αποδείχτηκε από φασματομετρία μάζας (native MS) και δοκιμασίες εντοπισμού πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων με το σύστημα BiFC. H παρούσα διατριβή είναι χωρισμένη σε τρία κεφάλαια. Στο πρώτο ερευνήθηκε η μοριακή βάση της εξειδίκευσης υποστρώματος στην ΝΑΤ οικογένεια και μελετήθηκε η εξέλιξη των μεταφορέων ασκορβικού πραγματοποιώντας αρχικά μια εκτενή φυλογενετική ανάλυση και στη συνέχεια μεταλλαγές στο μοτίβο ΝΑΤ του UapA. Την παραπάνω συστηματική μεταλλαξιγένεση ακολούθησε ορθολογικά σχεδιασμένος συνδυασμός υποκαταστάσεων ενώ απομονώθηκαν νέες επιπλέον υποκαταστάσεις μέσω τυχαίων μεταλλαξιγενέσεων. Τα αποτελέσματα συνολικά υποστηρίζουν ότι ο ρόλος κάποιων μερικώς συντηρημένων καταλοίπων του μοτίβου NAT στην εξειδίκευση του μεταφορέα UapA εξαρτάται από την ύπαρξη συγκεκριμένων αμινοξέων σε άλλες θέσεις. Επιπλέον παρουσιάζονται νέα δεδομένα για το πώς το κατάλοιπο Phe528, που βρίσκεται εκτός της θέσης πρόσδεσης υποστρώματος, μπορεί να επηρεάζει την εκλεκτικότητα του UapA. Tο δεύτερο μέρος αυτής της διατριβής αφορά τον ρόλο των αλληλεπιδράσεων του UapA με λιπίδια στη λειτουργία, τη σταθερότητα και τη μεταφορά του στη μεμβράνη. Πιο συγκεκριμένα, εξετάστηκε περαιτέρω ο ρόλος των αλληλεπιδράσεων στην επιφάνεια διμερισμού και διερευνήθηκε ο πιθανός ρόλος άλλων αλληλεπιδράσεων, που έχουν προβλεφθεί από MDs, στην περιφέρεια της επικράτειας πυρήνα του UapA. Βρέθηκε πως διακριτές αλληλεπιδράσεις του UapA με μεμβρανικά λιπίδια είναι απαραίτητες για τον εξαρχής σχηματισμό διμερών στο ενδοπλασματικό δίκτυο, ή την έξοδο από αυτό και την περαιτέρω στόχευση του στη μεμβράνη. Επιπλέον, μέσω τυχαίων μεταλλαξιγενέσεων απομονώθηκαν μεταλλαγές που επαναφέρουν τον σχηματισμό διμερών ή/και τη στόχευση στη μεμβράνη. Τέλος, στο τρίτο μέρος, χρησιμοποιώντας αποτελέσματα της παρούσας διατριβής έγινε για πρώτη φορά λειτουργική ετερόλογη έκφραση μιας NAT ομόλογης πρωτεΐνης από τα θηλαστικά στον A. nidulans.

Evolutionary selection of a 19-stranded mitochondrial β-barrel scaffold bears structural and functional significance

Transmembrane β-barrels of eukaryotic outer mitochondrial membranes (OMMs) are major channels of communication between the cytosol and mitochondria and are indispensable for cellular homeostasis. A structurally intriguing exception to all known transmembrane β-barrels is the unique odd-stranded, i.e. 19-stranded, structures found solely in the OMM. The molecular origins of this 19-stranded structure and its associated functional significance are unclear. In humans, the most abundant OMM transporter is the voltage-dependent anion channel. Here, using the human voltage-dependent anion channel as our template scaffold, we designed and engineered odd- and even-stranded structures of smaller (V216, V217, V218) and larger (V220, V221) barrel diameters. Determination of the structure, dynamics, and energetics of these engineered structures in bilayer membranes reveals that the 19-stranded barrel surprisingly holds modest to low stability in a lipid-dependent manner. However, we demonstrate that this structurally metastable protein possesses superior voltage-gated channel regulation, efficient mitochondrial targeting, and in vivo cell survival, with lipid-modulated stability, all of which supersede the occurrence of a metastable 19-stranded scaffold. We propose that the unique structural adaptation of these transmembrane transporters exclusively in mitochondria bears strong evolutionary basis and is functionally significant for homeostasis.

Enhancing the selectivity of optical sensors using synthetic transmembrane ion transporters

As proof-of-concept, we show that the non-selective anion sensor lucigenin can be converted to a selective iodide sensor by encapsulation into liposomes and the addition of transmembrane transporters.