Temperature Regulates Stability, Ligand Binding (Mg2+ and ATP) and Stoichiometry of GroEL/GroES Complexes

Chaperonins are nanomachines that harness ATP hydrolysis to power and catalyze protein folding, chemical action that is directly linked to the maintenance of cell function through protein folding/refolding and assembly. GroEL and the GroEL-GroES complex are archetypal examples of such protein folding machines. Here, variable-temperature-electrospray ionization (vT-ESI) native mass spectrometry is used to delineate the effects of solution temperature and ATP concentrations on the stabilities of GroEL and GroEL/GroES complexes. The results show clear evidences for destabilization of both GroEL14 and GroES7 at temperatures of 50 oC and 45 oC, respectively, substantially below the previously reported melting temperature (Tm ~ 70 oC). This destabilization is accompanied by temperature-dependent reaction products that have previously unreport-ed stoichiometries, viz. GroEL14-GroESx-ATPy, where x = 1, 2, 8 and y = 0, 1, 2, that are also dependent on Mg2+ and ATP concentrations. Variable-temperature native mass spectrometry reveals new insights about the stability of GroEL in response to several environmental effects: (i) temperature-dependent ATP binding to GroEL (ii) effects of temperature as well as Mg2+ and ATP concentrations on the stoichiometry of the GroEL-GroES complex, with Mg2+ showing greater effects compared to ATP; and, (iii) a change in the temperature-dependent stoichiometries of the GroEL-GroES complex (GroEL14-GroES7 vs GroEL14-GroES8) between 24 to 56 oC. The similarities between results obtained using native MS and cryo-EM (Clare et al., An expanded protein folding cage in the GroEL-gp31 complex. J Mol Biol 2006, 358, 905-11; Ranson et al., Allosteric signaling of ATP hydrolysis in GroEL–GroES complexes. Nat. Struct. Mol. Biol. 2006, 13, 147-152.) underscores the util-ity of native MS for investigations of molecular machines as well as identification of key intermediates involved in the chaperone-assisted protein folding cycle.

Temperature Regulates Stability, Ligand Binding (Mg2+ and ATP) and Stoichiometry of GroEL/GroES Complexes

Chaperonins are nanomachines that harness ATP hydrolysis to power and catalyze protein folding, chemical action that is directly linked to the maintenance of cell function through protein folding/refolding and assembly. GroEL and the GroEL-GroES complex are archetypal examples of such protein folding machines. Here, variable-temperature-electrospray ionization (vT-ESI) native mass spectrometry is used to delineate the effects of solution temperature and ATP concentrations on the stabilities of GroEL and GroEL/GroES complexes. The results show clear evidences for de-stabilization of both GroEL14 and GroES7 at temperatures of 50 oC and 45 oC, respectively, substantially below the pre-viously reported melting temperature (Tm ~ 70 oC). This destabilization is accompanied by temperature-dependent reaction products that have previously unreported stoichiometries, viz. GroEL14-GroESx-ATPy, where x = 1, 2, 8 and y = 0, 1, 2, that are also dependent on Mg2+ and ATP concentrations. Variable-temperature native mass spectrometry re-veals new insights about the stability of GroEL in response to several environmental effects: (i) temperature-dependent ATP binding to GroEL (ii) effects of temperature as well as Mg2+ and ATP concentrations on the stoichiome-try of the GroEL-GroES complex, with Mg2+ showing greater effects compared to ATP; and, (iii) a change in the temper-ature-dependent stoichiometries of the GroEL-GroES complex (GroEL14-GroES7 vs GroEL14-GroES8) between 24 to 56 oC. The similarities between results obtained using native MS and cryo-EM (Clare et al., An expanded protein folding cage in the GroEL-gp31 complex. J. Mol. Biol. 2006, 358, 905-11; Ranson et al., Allosteric signaling of ATP hydrolysis in GroEL–GroES complexes. Nat. Struct. Mol. Biol. 2006, 13, 147-152.) underscores the utility of native MS for investiga-tions of molecular machines as well as identification of key intermediates involved in the chaperone-assisted protein folding cycle.

Native flagellar MS ring is formed by 34 subunits with 23-fold and 11-fold subsymmetries

The bacterial flagellar MS ring is a transmembrane complex acting as the core of the flagellar motor and template for flagellar assembly. The C ring attached to the MS ring is involved in torque generation and rotation switch, and a large symmetry mismatch between these two rings has been a long puzzle, especially with respect to their role in motor function. Here, using cryoEM structural analysis of the flagellar basal body and the MS ring formed by full-length FliF from Salmonella enterica, we show that the native MS ring is formed by 34 FliF subunits with no symmetry variation. Symmetry analysis of the C ring shows a variation with a peak at 34-fold, suggesting flexibility in C ring assembly. Finally, our data also indicate that FliF subunits assume two different conformations, contributing differentially to the inner and middle parts of the M ring and thus resulting in 23- and 11-fold subsymmetries in the inner and middle M ring, respectively. The internal core of the M ring, formed by 23 subunits, forms a hole of the right size to accommodate the protein export gate.

The challenge of structural heterogeneity in the native mass spectrometry studies of the SARS-CoV-2 spike protein interactions with its host cell-surface receptor

Native mass spectrometry (MS) enjoyed tremendous success in the past two decades in a wide range of studies aiming at understanding the molecular mechanisms of physiological processes underlying a variety of pathologies and accelerating the drug discovery process. However, the success record of native MS has been surprisingly modest with respect to the most recent challenge facing the biomedical community - the novel coronavirus infection (COVID-19). The major reason for the paucity of successful studies that use native MS to target various aspects of SARS-CoV-2 interaction with its host is the extreme degree of structural heterogeneity of the viral protein playing a key role in the host cell invasion. Indeed, the SARS-CoV-2 spike protein (S-protein) is extensively glycosylated, presenting a formidable challenge for native mass spectrometry (MS) as a means of characterizing its interactions with both the host cell-surface receptor ACE2 and the drug candidates capable of disrupting this interaction. In this work we evaluate the utility of native MS complemented with the experimental methods using gas-phase chemistry (limited charge reduction) to obtain meaningful information on the association of the S1 domain of the S-protein with the ACE2 ectodomain, and the influence of a small synthetic heparinoid on this interaction. Native MS reveals the presence of several different S1 oligomers in solution and allows the stoichiometry of the most prominent S1/ACE2 complexes to be determined. This enables meaningful interpretation of the changes in native MS that are observed upon addition of a small synthetic heparinoid (the pentasaccharide fondaparinux) to the S1/ACE2 solution, confirming that the small polyanion destabilizes the protein/receptor binding.

Protein Secondary Structure Affects Glycan Clustering in Native Mass Spectrometry

Infection by the human noroviruses (hNoV), for the vast majority of strains, requires attachment of the viral capsid to histo blood group antigens (HBGAs). The HBGA-binding pocket is formed by dimers of the protruding domain (P dimers) of the capsid protein VP1. Several studies have focused on HBGA binding to P dimers, reporting binding affinities and stoichiometries. However, nuclear magnetic resonance spectroscopy (NMR) and native mass spectrometry (MS) analyses yielded incongruent dissociation constants (KD) for the binding of HBGAs to P dimers and, in some cases, disagreed on whether glycans bind at all. We hypothesized that glycan clustering during electrospray ionization in native MS critically depends on the physicochemical properties of the protein studied. It follows that the choice of a reference protein is crucial. We analysed carbohydrate clustering using various P dimers and eight non-glycan binding proteins serving as possible references. Data from native and ion mobility MS indicate that the mass fraction of β-sheets has a strong influence on the degree of glycan clustering. Therefore, the determination of specific glycan binding affinities from native MS must be interpreted cautiously.

Protein secondary structure affects glycan clustering in native mass spectrometry

Infection with human noroviruses (hNoV) for the vast majority of strains requires attachment of the viral capsid to histo blood group antigens (HBGA). The HBGA binding pocket is formed by dimers of the protruding domain (P dimers) of the capsid protein VP1. Several studies have focused on HBGA binding to P dimers, reporting binding affinities and stoichiometries. However, nuclear magnetic resonance spectroscopy (NMR) and native mass spectrometry (MS) analyses yielded incongruent dissociation constants (KD) for binding of HBGAs to P dimers and, in some cases, disagreed whether glycans bind at all. We hypothesized that glycan clustering during electrospray ionization in native MS critically depends on the physicochemical properties of the protein studied. It follows that the choice of the reference protein is crucial. We analyzed carbohydrate clustering using various P dimers and eight non-glycan binding proteins serving as possible references. Data from native and ion mobility MS indicate that the mass fraction of β-sheet has a strong influence on the degree of glycan clustering. Therefore, the determination of specific glycan binding affinities from native MS must be interpreted cautiously.

Adeno-associated virus capsid assembly is divergent and stochastic

Adeno-associated viruses (AAVs) are increasingly used as gene therapy vectors. AAVs package their genome in a non-enveloped T = 1 icosahedral capsid of ~3.8 megaDalton, consisting of 60 subunits of 3 distinct viral proteins (VPs), which vary only in their N-terminus. While all three VPs play a role in cell-entry and transduction, their precise stoichiometry and structural organization in the capsid has remained elusive. Here we investigate the composition of several AAV serotypes by high-resolution native mass spectrometry. Our data reveal that the capsids assemble stochastically, leading to a highly heterogeneous population of capsids of variable composition, whereby even the single-most abundant VP stoichiometry represents only a small percentage of the total AAV population. We estimate that virtually every AAV capsid in a particular preparation has a unique composition. The systematic scoring of the simulations against experimental native MS data offers a sensitive new method to characterize these therapeutically important heterogeneous capsids.

Structure-function relationships in transmembrane transporters

Οι μεταφορείς είναι διαμεμβρανικές πρωτεΐνες που πραγματοποιούν την επιλεκτική μεταφορά ουσιών μέσω των μεμβρανών. Τα μέλη της οικογένειας μεταφορέων NAT (Nucleobase Ascorbate Transporter family) είναι συμμεταφορείς H+ ή Na+ ειδικοί για την πρόσληψη είτε πουρινών και πυριμιδινών είτε L-ασκορβικού οξέος [1]. Παρά το γεγονός ότι αρκετά μέλη έχουν μελετηθεί εκτενώς σε γενετικό, βιοχημικό και κυτταρικό επίπεδο και οι δομές μελών από το βακτήριο Escherichia coli and τον μύκητα Aspergillus nidulans έχουν δημοσιευθεί παρέχοντας μια πληθώρα δεδομένων για τον μηχανισμό λειτουργίας, τα υπάρχοντα δεδομένα δεν είναι ικανά να εξηγήσουν πλήρως το πως καθορίζεται η εκλεκτικότητα των υποστρωμάτων [2,3]. Καλά χαρακτηρισμένα μέλη από τα βακτήρια, τους μύκητες και τα φυτά μεταφέρουν ειδικά πουρίνες η/και πυριμιδίνες ενώ τα θηλαστικά και άλλα σπονδυλωτά διαθέτουν μέλη που είναι ειδικά για L-ασκορβικό οξύ (SVCT1/2) αλλά και μέλη ειδικά για νουκλεοτιδικές βάσεις (π.χ. rSNBT1) [4,5]. Τα σπονδυλωτά διαθέτουν ένα επιπλέον παράλογο άγνωστης λειτουργιας (SVCT3) [5].Οι δομές από δυο μέλη της NAT οικογένειας είναι γνωστές [2,3,6]. Αυτές είναι η δομή του μεταφορέα ουρακίλης της E.coli UraA και του μεταφορέα ουρικού οξέος-ξανθίνης του A. nidulans UapA. Και οι δυο πρωτεΐνες αποτελούνται από 14 διαμεμβρανικά τμήματα που χαρακτηρίζονται από δύο ανεστραμμένες επαναλήψεις (7+7) που αντιστοιχούν σε δύο επικράτειες, την επικράτεια πυρήνα (core domain) και την επικράτεια διμερισμού (dimerization domain). Και οι δύο πρωτεΐνες σχηματίζουν διμερή, ο σχηματισμός των οποίων είναι απαραίτητος για την λειτουργία των μεταφορέων. Ο UapA είναι ένας συμμεταφορέας ουρικού οξέος-ξανθίνης/H+ του μύκητα A. nidulans και θεωρείται το πρότυπο, ευκαρυωτικό μέλος αυτής της οικογένειας επειδή είναι ένας από τους πιο εκτενώς χαρακτηρισμένους ευκαρυωτικούς μεταφορείς σε ότι αφορά τις σχέσεις-δομής λειτουργίας, την εκλεκτικότητα υποστρώματος, την ρύθμιση της έκφρασης και την υποκυτταρική διακίνηση [7]. Όλοι οι ΝΑΤ μεταφορείς περιέχουν ένα συντηρημένο μοτίβο στο 10ο διαμεμβρανικό τμήμα που ονομάστηκε ιστορικά σαν αλληλουχία-αναγνώρισης ΝΑΤ (NAT signature motif) το οποίο περιλαμβάνει κατάλοιπα που είναι απαραίτητα για την δέσμευση υποστρώματος και την εκλεκτικότητα ή για την κατάλυση της μεταφοράς [1,8]. Προηγούμενες μελέτες στον UapA έδειξαν ότι οι περισσότερες μεταλλαγές που επηρεάζουν την εκλεκτικότητα του, που έχουν προκύψει από τυχαίες μεταλλαξιγενέσεις, βρίσκονται εκτός της θέσης δέσμευσης υποστρώματος και της αλληλουχίας-μοτίβου ΝΑΤ [9–11]. Από αυτές οι πιο γνωστές μεταλλαγές αφορούν τα κατάλοιπα Arg481, Thr526 και Phe528 που εντοπίζονται κατά μήκος της πορείας κύλισης της επικράτειας πυρήνα πάνω στο διμερές. Επιπλέον, πρόσφατες μελέτες έδειξαν ότι συγκεκριμένες αληλλεπιδράσεις του UapA με μεμβρανικά λιπίδια στην επιφάνεια διμερισμού είναι απαραίτητες για τον σχηματισμό ή/και την σταθερότητα των λειτουργικών διμερών [12]. Πιο συγκεκριμένα, κατά την διαδικασία απομόνωσης του UapA συγκατακρημνίζονται και λιπίδια και η απομάκρυνση αυτών των λιπιδίων οδηγεί σε διάλυση του διμερούς συμπλόκου σε μονομερή. Προσθήκη φωσφο-ινοσιτιδίων (PIs) ή φωσφατιδυλοαιθανολαμίνης (PEs) οδήγησε στον επανασχηματισμό του διμερούς. Προσομοιώσεις μοριακής δυναμικής (MDs) προέβλεψαν την ύπαρξη μιας ειδικής θέσης δέσμευσης λιπιδίων στην επιφάνεια διμερισμού που αποτελείται από τρία κατάλοιπα αργινίνης Arg287, Arg478 και Arg479. Η αντικατάσταση αυτών των καταλοίπων οδήγησε σε πλήρη απώλεια λειτουργίας η οποία οφείλεται στην απώλεια σχηματισμού του λειτουργικού διμερούς σε μεγάλο ποσοστό της πρωτεΐνης όπως αποδείχτηκε από φασματομετρία μάζας (native MS) και δοκιμασίες εντοπισμού πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων με το σύστημα BiFC. H παρούσα διατριβή είναι χωρισμένη σε τρία κεφάλαια. Στο πρώτο ερευνήθηκε η μοριακή βάση της εξειδίκευσης υποστρώματος στην ΝΑΤ οικογένεια και μελετήθηκε η εξέλιξη των μεταφορέων ασκορβικού πραγματοποιώντας αρχικά μια εκτενή φυλογενετική ανάλυση και στη συνέχεια μεταλλαγές στο μοτίβο ΝΑΤ του UapA. Την παραπάνω συστηματική μεταλλαξιγένεση ακολούθησε ορθολογικά σχεδιασμένος συνδυασμός υποκαταστάσεων ενώ απομονώθηκαν νέες επιπλέον υποκαταστάσεις μέσω τυχαίων μεταλλαξιγενέσεων. Τα αποτελέσματα συνολικά υποστηρίζουν ότι ο ρόλος κάποιων μερικώς συντηρημένων καταλοίπων του μοτίβου NAT στην εξειδίκευση του μεταφορέα UapA εξαρτάται από την ύπαρξη συγκεκριμένων αμινοξέων σε άλλες θέσεις. Επιπλέον παρουσιάζονται νέα δεδομένα για το πώς το κατάλοιπο Phe528, που βρίσκεται εκτός της θέσης πρόσδεσης υποστρώματος, μπορεί να επηρεάζει την εκλεκτικότητα του UapA. Tο δεύτερο μέρος αυτής της διατριβής αφορά τον ρόλο των αλληλεπιδράσεων του UapA με λιπίδια στη λειτουργία, τη σταθερότητα και τη μεταφορά του στη μεμβράνη. Πιο συγκεκριμένα, εξετάστηκε περαιτέρω ο ρόλος των αλληλεπιδράσεων στην επιφάνεια διμερισμού και διερευνήθηκε ο πιθανός ρόλος άλλων αλληλεπιδράσεων, που έχουν προβλεφθεί από MDs, στην περιφέρεια της επικράτειας πυρήνα του UapA. Βρέθηκε πως διακριτές αλληλεπιδράσεις του UapA με μεμβρανικά λιπίδια είναι απαραίτητες για τον εξαρχής σχηματισμό διμερών στο ενδοπλασματικό δίκτυο, ή την έξοδο από αυτό και την περαιτέρω στόχευση του στη μεμβράνη. Επιπλέον, μέσω τυχαίων μεταλλαξιγενέσεων απομονώθηκαν μεταλλαγές που επαναφέρουν τον σχηματισμό διμερών ή/και τη στόχευση στη μεμβράνη. Τέλος, στο τρίτο μέρος, χρησιμοποιώντας αποτελέσματα της παρούσας διατριβής έγινε για πρώτη φορά λειτουργική ετερόλογη έκφραση μιας NAT ομόλογης πρωτεΐνης από τα θηλαστικά στον A. nidulans.