Synthesis of Dacus Pheromone, 1,7-Dioxaspiro[5.5]Undecane and Its Encapsulation in PLLA Microspheres for Their Potential Use as Controlled Release Devices

Olive fruit fly Dacus oleae is a well-known pest infecting the bark of olive fruit, leading to reduction of extracted olive oil properties. Among chemicals proposed for Dacus oleae population control, pheromone 1,7-dioxaspiro(5.5)undecane (DSU), Dacus pheromone, is considered as a promising agent, which is added in several traps. However, all proposed systems manage to sufficiently deliver DSU for only two weeks. Furthermore, an additional problem is the limited available amount of pheromone to use in such systems. To overcome this, in the present study, a novel synthetic procedure of DSU is described, including only five steps. Intermediate products were studied by High Resolution Mass Spectroscopy Electrospray Ionization (HRMS-ESI) (m/z), while the resulting DSU was further characterized by 1H and 13C-NMR. Synthesized DSU was further encapsulated in poly(L-lactic acid) (PLLA) microparticles in three different concentrations; 5, 10 and 20% w/w. Its successful incorporation was studied by FT-IR, XRD and differential scanning calorimeter (DSC) while two procedures, liquid extraction and solid phase microextraction, followed by GC-MS analysis, was used for quantification of pheromone to microparticles. It was found that microparticles loading was over 85% for all three formulations. Its release showed a prolonged profile for microparticles containing 20% w/w DSU, lasting four weeks, while the quantity of DSU released reached 100%. These microparticles could be appropriate to control Dacus oleae population.

Προσδιορισμός των οργανοφωσφορικών φυτοφαρμάκων και των μεταβολιτών τους στο αμνιακό υγρό και μελέτη της επίδρασής τους στην εμβρυϊκή ανάπτυξη

Σκοπός της μελέτης αυτής ήταν να εκτιμήσει την έκθεση του εμβρύου στα οργανοφωσφορικά φυτοφάρμακα, με μέτρηση των μη ειδικών διαλκυλο- φωσφορικών μεταβολιτών τους (dialkyl phosphate metabolites ή DAPs) στο αμνιακό υγρό, και να εξετάσει την πιθανή συσχέτιση ανάμεσα στην προγεννητική έκθεση σε αυτούς τους παράγοντες, την εμβρυϊκή ανάπτυξη και πιθανά προβλήματα υγείας.Η μελέτη διεξήχθη από τον Αύγουστο του 2006 έως το Μάιο του 2008. Συλλέχτηκαν δείγματα αμνιακού υγρού από 415 γυναίκες με μονήρη κύηση στο δεύτερο τρίμηνο της κύησης, κατά τη διάρκεια προγραμματισμένης αμνιοπαρακέντησης (που γινόταν βάσει συγκεκριμένων ιατρικών ενδείξεων), στο τμήμα Εμβρυομητρικής της Μαιευτικής & Γυναικολογικής κλινικής του Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου Ηρακλείου. Τα δείγματα αναλύθηκαν στο εργαστήριο Τοξικολογίας, Ιατρικής Σχολής Πανεπιστημίου Κρήτης. Τα DAPs που μετρήθηκαν ήταν τα dimethyl phosphate (DMP), dimethyl thiophosphate (DMTP), diethyl phosphate (DEP), diethyl thiophosphate (DETP) και diethyl dithiophosphate (DEDTP). Οι DAPs εκχυλίστηκαν μετά από υγρή-υγρή επεξεργασία των δειγμάτων (liquid- liquid extraction) και μετρήθηκαν με την αναλυτική τεχνική της αέριας χρωματογραφίας σε συνδυασμό με φασματομετρία μάζας (gas chromatography– mass spectrometry). Είκοσι δύο εγκυμοσύνες είχαν ως αποτέλεσμα είτε απώλεια του εμβρύου είτε τερματισμό της εγκυμοσύνης εξαιτίας χρωμοσωμικών ανωμαλιών ή μεγάλων εμβρυϊκών ελαττωμάτων. Η μέση ηλικία της μητέρας ήταν 32,7 (SD = 5,7). Η μέση ηλικία κύησης κατά την αμνιοπαρακέντηση ήταν 18,5 εβδομάδες (SD = 2,5).Η έκθεση σε οργανοφωσφορικά φυτοφάρμακα, εκφραζόμενη ως άθροισμα DMP, DEP, DAP σε δείγματα αμνιακού υγρού, κυμάνθηκε από 0,07 έως 222,9 ng / ml, 0,19 έως 254,3 ng / ml και 0,05 έως 252,6 ng / ml, αντίστοιχα. Ο DEP ήταν ο μεταβολίτης με την υψηλότερη συχνότητα ανίχνευσης (90,5%), ακολουθούμενη από DETP (74,0%), DMP (60,0%) και DEDTP (39,5%). Σχεδόν όλα τα δείγματα αμνιακού υγρού (97,8%) παρείχαν τουλάχιστον έναν θετικό μεταβολίτη (DMP, DEP, DMTP, DETP, DEDTP), οι οποίοι είναι συνηθισμένοι μεταβολίτες περίπου 75% οργανοφωσφορικών εντομοκτόνων. Δεν παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική διαφορά στα μετρούμενα επίπεδα DAPs μεταξύ αστικών και αγροτικών περιοχών (97,8% στις αστικές περιοχές έναντι 97,9% στις αγροτικές περιοχές). Αυτό καθιστά δύσκολο να εντοπιστεί εάν η κυρίαρχη πηγή έκθεσης είναι η διατροφή και η χρήση φυτοφαρμάκων στο σπίτι ή η γεωργία. Η ηλικία της μητέρας δεν επηρέασε τα επίπεδα των sumDAPs (p> 0.400).Όλα τα μετρηθέντα DAP στο αμνιακό υγρό φαίνεται να συνδέονται θετικά μεταξύ τους (p <0,002) και αυτό θα μπορούσε ενδεχομένως να αποδοθεί στην ταυτόχρονη έκθεση των συμμετεχόντων σε οργανοφωσφορικά φυτοφάρμακα μεθυλίου και αιθυλίου.Δεν υπήρξε στατιστικά σημαντική διαφορά με το φύλο του νεογνού και την εκατοστιαία θέση της περιφέρειας της κεφαλής στα επίπεδα των DAPs. Τα μακροσωμικά νεογνά είχαν σημαντικά περισσότερα συνολικά επίπεδα των DMPs (p= 0.043), παρουσιάζοντας μια γραμμική θετική συσχέτιση με την εκατοστιαία θέση του βάρους γέννησης (b= 4.43, p= 0.016). Υπάρχει επίσης μια εποχική διακύμανση των επιπέδων DAPs που μπορεί να εξηγηθεί από τη χρήση συγκεκριμένων οργανοφωσφορικών φυτοφαρμάκων σε ορισμένους τύπους καλλιεργειών. Τα sumDMPs είχαν αυξημένα επίπεδα το φθινόπωρο του 2006 και του 2007 και την άνοιξη του 2008. Τα DMPs προέρχονται από O,Odimethyl-υποκατεστημένα οργανοφωσφορικά φυτοφάρμακα όπως το malathion και το dimethoate. Η πιο πιθανή αιτία αύξησης των επιπέδων dimethyl phosphate μεταβολίτη το φθινόπωρο του 2006 και του 2007 είναι ο συστηματικός ψεκασμός των ελαιόδεντρων για dacus oleae με τη χρήση fenthion και dimethoate κατά την περίοδο Αυγούστου - Σεπτεμβρίου, που είχε εγκριθεί από το Υπουργείο Αγροτικής Ανάπτυξης και Τροφίμων στην Ελλάδα. Τα sumDEPs παρουσίασαν αυξημένα επίπεδα το χειμώνα 2006-2007 και το φθινόπωρο του 2007. Τα DEP που προέρχονται από O,O-diethyl-υποκατεστημένα οργανοφωσφορικά φυτοφάρμακα όπως το chlorpyrifos και το diazinon και τα αυξημένα επίπεδα τους μπορεί να οφείλονται στην ευρεία χρήση diazinon σε αμπελώνες και φρούτα .Συμπερασματικά, καθώς τα DAPs είναι ανιχνεύσιμα στο αμνιακό υγρό, μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως πιθανοί βιοδείκτες της παρελθοντικής έκθεσης του εμβρύου στα οργανοφωσφορικά φυτοφάρμακα. Τα συνολικά επίπεδα των DMPs φαίνεται να σχετίζονται με το βάρος γέννησης ανεξάρτητα από άλλες μεταβλητές.

Some enzymatic activities registered in eggs and gut tissues of the olive fruit fly, Dacus oleae (Gmelin)

Nineteen enzymatic activities of eggs, gut tissues of larvae and adults of Dacus oleae have been determined using the API-ZYM micromethod. The enzymatic activities of eggs were much weaker than those of larval or adult guts. The activities increased progressively to the L2 and L3. The lack of feeding caused a reduction of certain activities in larvae (alkaline phosphatase, esterases, aminopeptidases) but not in adults. The addition of streptomycin to the food of adults, to obtain “aposymbiotic” individuals, did not have a clear effect on the activities of the insect’s various stages. Although the enzymes studied were not the only ones that occur in the insect’s gut tissues, it seems that there are few similarities between the enzymatic system of larvae and that of adults, most probably because of the different content of the two diets in essential nutrients such as amino acids, proteins, and lipids.

Effect of Combining Food and Sex Attractants on the Capture of Dacus oleae Flies

Sex pheromonal compounds i.e. the most potent male attractants, and ammonia, one of the most potent female attractants available today for Dacus oleae (Gmelin), were combined on the same trap. This combination resulted in an overall increase of female captures as compared to those of ammonia alone, but a decrease of male captures as compared to those of pheromone alone. Deviations from this overall effect were observed during certain periods of the year and are caused by varying environmental and biological factors which influence insect response to pheromones. Explanations for these results based on recent findings concerning the pheromone system of D. oleae are presented here.

Βacterial flora isolated from the oesophageal bulb of the olive fruit fly Dacus oleae (Gmelin)

In a study of the bacterial flora occurring in the adults of the olive fruit fly, Dacus oleae (Gmelin) (Diptera: Tephritidae), oesophageal diverticulum, a total of 28 strains were obtained. Six of them were Gram – negative and identified as Pseudomonas niendocina, Morarella nonliquefasciens (2), Alcaligenes sp., Enterobacter cloacae (2) and 22 Gram-positive classified as Kurthia sp., Staphylococcus subgroup VI, Micrococcus roseus, Bacillus pumilus, B. licheniformis (3) and B. subtilis(15). None of the above bacteria are strictly fixed and constantly present in the oesophageal diverticulum, suggesting that the bacterial flora associated with D. oleae depends on environmental factors, and could be used as a nutrient source for the insect apart from its possible other symbiotic role.

Preliminary search for a νirus in Dacus oleae Gmel. populations in Northern Greece

A large number of larvae of Dacus oleae were collected from infested olives in Northern Greece, and a small proportion of these were found to be dead. Adult flies were caught in McPhail traps at the same locations. The larvae and adults were fractionated by a series of steps designed to identify occluded and nonoccluded viruses. Virus-like particles were identified in small amounts only in the dead larvae.

Effect of size, color and height of pheromone baited sticky traps on captures of Dacus oleae flies

The size of sticky pheromone traps has no effect on Dacus οleae catches when insect population densities are low. At high population densities trap catches increase with surface area. There were no differences in the numbers of D. οleae caught on yellow and white pheromone traps in periods of high pheromone effectiveness, which coincide with periods of high insect reproductive activity. During periods of reduced pheromone effectiveness, due either to low temperatures at the time of pheromone activity (dusk) or reduced insect reproductive activity, traps of yellow hues tend to capture more insects than traps of white color. The height at which pheromone traps are located inside the tree canopy has no effect on catches of D. οleae.

Funicular sensilla of Dαcus oleαe: fine structural characteristics

The funicular sensilla in Dacus oleae (Gmelin) (Diptera: Tephritidae) are found both on the surface and in the single olfactory pit. The surface sensilla are of three types: two are single-walled, the third is double-walled. The fine structure of these three sensillar types indicates olfactory function capabilities. The single-walled sensilla are, as a rule, innervated by two sensory cells. The long single-walled sensilla have unbranched sensory processes, whereas in the short they are branched. The double-walled sensilla usually possess three sensory cells that send unbranched sensory processes towards the tip of the hair. The olfactory pit sensilla are of two types: one type is identical to the double-walled type found on the funicular surface. The second type is poreless and found only in the olfactory pit. The poreless sensilla are innervated by three sensory cells, two of which terminate inside the cuticular hair, while the third does not enter inside the hair but terminates freely below it. The functional capabilities of this sensillar type are unknown.

Αn assessment of components of crop loss due to infestation by Dacus oleae, in Corfu

An assessment of components of crop loss caused by the olive fly, Dacus oleae, was carried out in Corfu during the years 1976-1979. The results indicate that the most important component of crop loss due to D. oleae infestation is the preharvest fruit drop induced, mainly, by the third stage larva. Using three starting dates, which coincided with the main periods of infestation between July and October, estimates were made of the proportions of infested fruits induced to fall prematurely before the start of harvesting in November. The larva of D. oleae consumes only a small proportion of the fruit pulp (on average 4.48 %). The effect of infestation on the acidity of the oil is indirect and it is important only when the fruits remain for over a week on the ground before they are collected. Compensation by the tree for premature fruit drop caused by D. oleae infestation does not appear to be of any significance in assessing crop loss.

Υellow sticky rectangle with ammonium acetate slow-release dispenser: an efficient long-lasting trap for Dacus oleae

The combination of a yellow color sticky rectangle with an ammonium acetate slow-release dispenser (YAA) was compared to a yellow sticky rectangle (Y) and to a McPhail glass trap with BuminalTM(MB), EntomozylTM(ME), or ammonium sulfate (MAS) odor lure in a 2% water solution, from the beginning of August till December in an olive grove. When total olive fruit fly, Dacus oleae (Gmelin) (Diptera: Tephritidae), captures were compared, no large differences were detected among YAA, MB and ME traps, while Y and MAS ones were found much inferior. When expressed as a ratio to YAA, total captures were: 1 (YAA), 0.95 (MB), 0.70 (ME), 0.33 (Y) and 0.08 (MAS). In the fall (high population density), both yellow traps showed very high catches, while McPhail odor traps had comparatively reduced effectiveness, apparently due to cool humid weather. The opposite was true in August-September (hot dry weather, low population density). McPhail traps were serviced every 5 days (summer) or 7 days (fall), while YAA and Y traps were replaced by new ones only once, at the beginning of October. The am­monium acetate dispenser could last much longer but traps had been covered by insects and debris.