Diabetična retinopatija kot subklinično vnetje: Analiza citokinov v steklovini in serumu

Izhodišče: Diabetično retinopatijo lahko opredelimo kot kronično subklinično vnetje. Želeli smo ugotoviti razlike v ravneh vnetnih citokinov med steklovino in serumom pri bolnikih s proliferativno diabetično retinopatijo (PDR) pri kontrolni skupini ter primerjati ravni citokinov v steklovini glede na aktivnost PDR. Boljše poznavanje vnetnega dogajanja v očesu bolnikov s PDR bi lahko prispevalo k razvoju novih načinov zdravljenja teh bolnikov.Metode: V raziskavo smo vključili 37 bolnikov (37 oči) s PDR, pri katerih je bila potrebna vitrektomija, ter 20 bolnikov (20 oči) z idiopatskim foramnom makule (FM), ki so predstavljali kontrolno skupino. Glede na pregled pred operacijo in oceno očesnega ozadja med samim posegom smo opredelili aktivnost PDR. V steklovini in serumu smo s citometrično metodo CBA (angl. Cytometric Bead Array) analizirali citokine interlevkin 1β (IL-1β), dejavnik tumorske nekroze α (TNF-α), makrofagni vnetni protein 1α (MIP-1α), makrofagni vnetni protein 1β (MIP-1β), monocitni kemotaktični protein 1 (MCP-1), žilni endotelni rastni dejavnik (VEGF), interlevkin 6 (IL-6), interlevkin 8 (IL-8), interlevkin 10 (IL-10) in interlevkin 12 (IL-12).Rezultati: Ravni vseh citokinov so se v steklovini pomembno razlikovale od ravni v serumu. Raven MCP-1, VEGF, IL-6, IL-8 v steklovini bolnikov s PDR je bila statistično pomembno višja v primerjavi z ravnijo v steklovini pri bolnikih v kontrolni skupini, raven MIP-1α, IL-10 in IL-12 v steklovini bolnikov s PDR je bila statistično pomembno nižja v primerjavi z bolniki v kontrolni skupini (p < 0,05). Ravni citokinov v serumu bolnikov s PDR se niso pomembno razlikovale od ravni citokinov pri kontrolni skupini. Bolniki z aktivno PDR so imeli v steklovini višjo raven MCP-1, VEGF, IL-6 in IL-8 kot bolniki z inaktivno PDR, a razlike niso bile statistično značilne.Zaključek: Z našo analizo smo potrdili pomembne razlike v ravneh citokinov med steklovino in serumom pri bolnikih s PDR, kar kaže na pomen lokalnega vnetnega dogajanja v očesu pri PDR. Višje ravni MCP-1, VEGF, IL-6 in IL-8 nakazujejo aktivnost PDR.

Lungenfunktion, Lung Clearance Index und bronchiale Entzündung bei Kindern und Jugendlichen mit Bronchiolitis obliterans

Zusammenfassung Einleitung Die Bronchiolitis obliterans (BO) ist eine sehr seltene, chronische Lungenerkrankung, die vereinzelt nach schweren Atemwegsinfektionen oder als Folge von Stammzell- und Lungentransplantation auftritt. Ziel der Arbeit war es, die Lungenfunktion und die bronchiale Entzündung bei BO-Patienten im Jugend- und Kindesalter zu untersuchen. Zudem sollte das Potenzial des LCI in der Diagnostik dieser Patienten untersucht werden. Methoden Es wurden 16 BO-Patienten (Alter:Median 16,7; 9,6–25,3 Jahre) und 17 gesunde Probanden (Alter: Median 16,6; 7,6–25,0 Jahre) untersucht. Neben der Untersuchung der Lungenfunktion (FVC, FEV1, MEF25, RV und RV/TLC) mittels Bodyplethysmografie erfolgte eine Reversibilitätstestung nach Gabe von 400 μg Salbutamol. Die Bestimmung des LCI erfolgte mittels Multiple Breath Washout (MBW)-Methode. Zusätzlich wurde die Zellverteilung und das Zytokinprofil (IL-1ß, IL-6, IL-8, TNF-α)mittels Cytometric Bead Array (CBA) im induzierten Sputum analysiert. Ergebnisse FVC, FEV1 und MEF25 der BO-Patienten waren signifikant niedriger, das RV und die RV/TLC jedoch signifikant erhöht im Vergleich zur Kontrollgruppe. Eine bronchiale Reversibilität zeigte sich bei 3 Patienten. Der LCI war bei den BO-Patienten gegenüber der Kontrollgruppe signifikant erhöht (Median 10,24 vs. 7,1) und korrelierte signifikant mit dem MEF25 (p < 0,0001). Im induzierten Sputum fand sich eine signifikante Erhöhung der Gesamtzellzahl, der neutrophilen Granulozyten sowie von IL-6 und IL-8 (p < 0,01). Schlussfolgerung Die Lungenfunktion ist bei Kindern und Jugendlichen mit BO stark eingeschränkt. Zudem erwies sich der LCI als sensitiver und reproduzierbarer Marker zur Beurteilung der obstruktiven Beeinträchtigung der kleinen Atemwege. Im induzierten Sputum ist eine von Neutrophilen dominierte bronchiale Entzündung nachweisbar.

Lungenfunktion, Lung Clearance Index und bronchiale Entzündung bei Kindern und Jugendlichen mit Bronchiolitis obliterans

Zusammenfassung Einleitung Die Bronchiolitis obliterans (BO) ist eine sehr seltene, chronische Lungenerkrankung, die vereinzelt nach schweren Atemwegsinfektionen oder als Folge von Stammzell- und Lungentransplantation auftritt. Ziel der Arbeit war es, die Lungenfunktion und die bronchiale Entzündung bei BO-Patienten im Jugend- und Kindesalter zu untersuchen. Zudem sollte das Potenzial des LCI in der Diagnostik dieser Patienten untersucht werden. Methoden Es wurden 16 BO-Patienten (Alter: Median 16,7; 9,6 – 25,3 Jahre) und 17 gesunde Probanden (Alter: Median 16,6; 7,6 – 25,0 Jahre) untersucht. Neben der Untersuchung der Lungenfunktion (FVC, FEV1, MEF25, RV und RV/TLC) mittels Bodyplethysmografie erfolgte eine Reversibilitätstestung nach Gabe von 400 µg Salbutamol. Die Bestimmung des LCI erfolgte mittels Multiple Breath Washout (MBW)-Methode. Zusätzlich wurde die Zellverteilung und das Zytokinprofil (IL-1ß, IL-6, IL-8, TNF-α) mittels Cytometric Bead Array (CBA) im induzierten Sputum analysiert. Ergebnisse FVC, FEV1 und MEF25 der BO-Patienten waren signifikant niedriger, das RV und die RV/TLC jedoch signifikant erhöht im Vergleich zur Kontrollgruppe. Eine bronchiale Reversibilität zeigte sich bei 3 Patienten. Der LCI war bei den BO-Patienten gegenüber der Kontrollgruppe signifikant erhöht (Median 10,24 vs. 7,1) und korrelierte signifikant mit dem MEF25 (p < 0,0001). Im induzierten Sputum fand sich eine signifikante Erhöhung der Gesamtzellzahl, der neutrophilen Granulozyten sowie von IL-6 und IL-8 (p < 0.01). Schlussfolgerung Die Lungenfunktion ist bei Kindern und Jugendlichen mit BO stark eingeschränkt. Zudem erwies sich der LCI als sensitiver und reproduzierbarer Marker zur Beurteilung der obstruktiven Beeinträchtigung der kleinen Atemwege. Im induzierten Sputum ist eine von Neutrophilen dominierte bronchiale Entzündung nachweisbar.

Ανάπτυξη in vitro συστημάτων καλλιεργειών δενδριτικών κυττάρων για την αντιγονοπαρουσίαση τεχνητών αντιγόνων σε Τ κύτταρα ασθενών με σκλήρυνση κατά πλάκας με απώτερο σκοπό τη δημιουργία θεραπευτικών εμβολίων

Η σκλήρυνση κατά πλάκας (ή πολλαπλή σκλήρυνση, ΠΣ) είναι μια αυτοάνοση νόσος που προσβάλει το κεντρικό νευρικό σύστημα και o παθογενετικός μηχανισμός της ενορχηστρώνεται κυρίως από αυτοαντιδρώντα Τ και Β κύτταρα τα οποία έχουν ξεφύγει από την επιτήρηση του μηχανισμού της ανοσολογικής ανοχής. Η επαγωγή της ανοχής μέσω δενδριτικών κυττάρων (DCs) είναι μία νέα στρατηγική για τη θεραπεία της. Σκοπός της παρούσας ερευνητικής εργασίας ήταν η δημιουργία και η μελέτη ενός συστήματος αντιγονοπαρουσίασης του πεπτιδίου MOG35-55 συζευγμένο με μαννάνη από ανοσοανεκτικά δενδριτικά κύτταρα (tolDCs), τα οποία παρουσιάζουν το πεπτίδιο και επάγουν την ανοχή των Τ κύτταρων. Στο πειραματικό πρωτόκολλο που αναπτύξαμε, απομονώθηκαν περιφερικά μονοπύρηνα κύτταρα του αίματος (PBMCs), από υγιείς δότες και ασθενείς με RR-MS, και τα οποία διαφοροποιήθηκαν σε διάφορους τύπους DCs υπό την επίδραση IL-4 και GM-CSF, παρουσία δεξαμεθαζόνης(DEXA) ή βιταμίνης D3(VitD3) ή και των δύο. Την 6η ημέρα της καλλιέργειας τους τα DCs «φορτώθηκαν» με το πεπτίδιο ή τη μαννάνη και έλαβαν το σήμα ωρίμανσής τους μέσω του LPS. Την 8η ημέρα συνκαλλιεργήθηκαν με αυτόλογα PBMCs παρουσία IL-2 για 3 ή 4 κύκλους αντιγονοπαρουσίασης. Ο φαινότυπος των DCs και των T-κυτταρικών πληθυσμών προσδιορίστηκε με κυτταρομετρία ροής. Τα κυτταροκινικά προφίλ των DC και των Τ-κυττάρων αποτελούμενα από τις κυτταροκίνες: IL-1β/IL-2/IL-4/IL-6/IL-8/IL-10/IL-12p70/IL-17A/TNF-α/IFN-γ, μετρήθηκαν με Cytometric Bead Array και ο TGF-β1 με ELISA.Η μελέτη και η ανάλυση των DCs την 8η ημέρα της καλλιέργειάς τους έδειξε ότι η χαμηλότερη επιφανειακή έκφραση των μορίων CD80 και CD86 και η μεγαλύτερη παραγωγή IL-10 από τα tolDCs σε σύγκριση με τα ώριμα DCs μας επιτρέπει το σαφή φαινοτυπικό και λειτουργικό διαχωρισμό μεταξύ ώριμων και ανοσοανεκτικών DCs.Οι συνκαλλιέργειες των PBMCs με τα διάφορα είδη DCs, μετά από 3 ή 4 κύκλους αντιγονοπαρουσίασης, προήγαγαν τη δημιουργία μνήμης στα CD4 και όχι στα CD8 T κύτταρα. Από τον προσδιορισμό των επίπεδων ενεργοποίησης των CD4 T κυττάρων παρατηρήθηκε καταστολή της ενεργοποίησής τους στις συνκαλλιέργειες με τα tolDCs που αντιγονοπαρουσίασαν το πεπτίδιο. Παράλληλα, παρατηρήσαμε αύξηση των ποσοστών των εξαντλημένων CD4+PD-1+ και των ρυθμιστικών CD4+CD25highFoxP3+ Τ κυττάρων και την έκκριση IL-10 ή και TGF-β1. Τα αποτελέσματα μας υποδεικνύουν ότι τα tolDCs που αναπτύξαμε in vitro επάγουν την ανοχή στα Τ κύτταρα και θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν σαν θεραπευτικό εμβόλιο για την ΠΣ.

Γονιδιακή έκφραση και μελέτη παραγόντων που επηρεάζουν την πλαστικότητα των ανθρώπινων Τ βοηθητικών λεμφοκυττάρων σε μεταγγιζόμενους ασθενείς

Εισαγωγή: Ο πληθυσμός των CD4+ Τ κυττάρων είναι υπεύθυνος για την οργάνωση και ισορροπία του ανοσοποιητικού συστήματος και την αντιμετώπιση ειδικά έναντι σε κάθε αντιγόνο. Αυτό επιτυγχάνεται λόγω της πλαστικότητας των CD4+ κυττάρων μέσα (διαφοροποιούνται τα ρυθμιστικά Τ κύτταρα-Tregs) και κατά την έξοδό τους (παρθενικά CD4+ Τ κύτταρα) από τον θύμο καθώς και τα ερεθίσματα που δέχονται στο μικροπεριβάλλον τους κυρίως από αντιγόνα και κυτταροκίνες. Με τις αλλογενείς μεταγγίσεις αίματος (ABT) τεράστιος αριθμός αντιγόνων εισέρχεται στο σώμα του λήπτη και τον τροποποιεί με μηχανισμό ο οποίος δεν είναι πλήρως κατανοητός μέχρι σήμερα.Σκοπός της εργασίας: Στην παρούσα εργασία, μελετήθηκαν ο τρόπος και οι παράγοντες που επηρεάζουν την πλαστικότητα των CD4+ Τ κυττάρων υπό την επίδραση της μετάγγισης σε ασθενείς που είχαν υποβληθεί σε προγραμματισμένο χειρουργείο αρθροπλαστικής γόνατος ή ισχίου χωρίς άλλες ανοσοτροποποιητικές νόσους. Η διάκριση των ασθενών έγινε με βάση αν έλαβαν μετάγγιση (54 ασθενείς-group1) ή όχι (35 ασθενείς- group2).Ασθενείς, υλικά και μέθοδοι: Ηπαρινισμένα δείγματα ολικού αίματος από 89 ασθενείς συλλέχτηκαν πριν το χειρουργείο (BS) και αμέσως μετά το χειρουργείο μέχρι την πρώτη εβδομάδα (days 0-7) ή μέχρι το εξιτήριο, ένα μήνα μετά το χειρουργείο (1month) και κατά τον επανέλεγχο των ασθενών (>3months). Σε απομονωμένα PBMC’s ασθενών προσδιορίστηκε η μεταβολή των CD4+CD25high/+Foxp3+ (nTreg), CD4+CD25+CD127low/- (iTreg) και άλλων CD3+ πληθυσμών με την μέθοδο FACS και στο πλάσμα των ασθενών προσδιορίστηκαν οι συγκεντρώσεις των κυτταροκινών IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, TNF-α, IFN-γ με την μέθοδο Cytometric Bead Array (CBA) και των υποδοχέων TNF-RI(p55/p60), TNF-RII(p75/p80), TGF-β1 και TGF-β2 την μέθοδο της ELISA. Επίσης πραγματοποιήθηκαν πειράματα λειτουργικότητας των Tregs σε δείγματα μεταγγισμένων και μη μεταγγισμένων ασθενών, μέσα στην πρώτη μετεγχειρητική εβδομάδα. Σε αυτά καλλιεργήθηκαν απομονωμένα Tregs και Teff από τον ίδιο ασθενή για 72 ώρες σε διάφορους λόγους παρουσία PHA και CFSE. Και τέλος, έγινε συσχέτιση της μετάγγισης με την σοβαρότητα των μετεγχειρητικών επιπλοκών και την παραμονή των ασθενών στο νοσοκομείο. Αποτελέσματα: Από τα παραπάνω πειράματα παρατηρήθηκε σημαντική αύξηση των CD4+CD25high/+Foxp3+ και CD4+CD25+CD127low/- μέχρι την πρώτη μετεγχειρητική εβδομάδα στους μεταγγισμένους αλλά όχι στους μη-μεταγγισμένους ασθενείς. Τα πειράματα λειτουργικότητας απέδειξαν ότι τα Tregs μεταγγισμένων και μη μεταγγισμένων ασθενών είναι λειτουργικά και ικανά να προκαλούν αναστολή του πολλαπλασιασμού των Teff, ωστόσο, τα Tregs των μεταγγισμένων ασθενών μπορούσαν να καταστέλλουν ισχυρότερα και παρουσία μεγαλύτερου αριθμού Teff στην καλλιέργεια. Από τις κυτταροκίνες που ανιχνεύτηκαν στο πλάσμα των ασθενών η IL-6, και οι υποδοχείς TNF-RI(p55/p60) και TNF-RII(p75/p80) εμφάνισαν σημαντική αύξηση ενώ σημαντική μείωση εμφάνισε ο TGF-β1 και ιδιαίτερο ρόλο φαίνεται να παίζουν οι IL-2 και TGF-β2. Παρατεταμένη νοσηλεία καθώς και αυξημένες και πιο σοβαρές μετεγχειρητικές επιπλοκές φαίνεται να εμφανίζουν οι μεταγγισμένοι ασθενείς συγκριτικά με τους μη-μεταγγισμένους.Συμπεράσματα: Οι ασθενείς που δέχονται μετάγγιση κατά την διάρκεια του χειρουργείου είναι ανοσοκατεσταλμένοι για τις πρώτες μέρες μετά την μετάγγιση και αυτό οφείλεται στον αυξημένο αριθμό των ρυθμιστικών τους κυττάρων και την επαγωγή των προφλεγμονωδών αποκρίσεων, έτσι οι ασθενείς αναπτύσσουν Th1 απόκριση και πολλαπλασιασμό των Tregs τα οποία καταστέλλουν τον πολλαπλασιασμό των Teff ισχυρότερα. Έτσι σταδιακά, τα Tregs καταστέλλουν τις προφλεγμονώδης αποκρίσεις μέχρι να επανέλθει η ισορροπία των ληπτών μετά την εγχείρηση. Ωστόσο, η ανοσοκαταστολή οφειλόμενη στην μετάγγιση που παρατηρείται τις πρώτες μέρες, οδηγεί τους ασθενείς σε παρατεταμένη νοσηλεία και αυξημένες μετεγχειρητικές επιπλοκές.