Identification of CHEK2 germline mutations in BRCA1/2 and PALB2 negative breast and ovarian cancer patients

Introduction: The CHEK2 gene is known to be an important signal transducer involved in DNA repair, apoptosis, or cell cycle arrest in response to DNA damage. The mutations in this gene have been associated with a wide range of cancers, both sporadic and hereditary. Germline CHEK2 mutations are linked to an increased risk of breast cancer. Therefore, the aim of this study was to identify the prevalence of CHEK2 variants in BRCA1/2 and PALB2 negative early-onset patients with breast cancer and/or ovarian cancer in a Turkish population for the first time. Methods: The study included 95 patients with BRCA1/2 and PALB2 negative early-onset breast cancer and/or ovarian cancer and also 60 unaffected women. All the intron/exon boundaries and coding exons of CHEK2 were subjected to mutational analysis by heteroduplex analysis and DNA sequencing. Results: A total of 16 CHEK2 variants were found in breast cancer patients within the Turkish population. CHEK2 c.1100delC mutation studied in the CHEK2 gene most frequently was not detected in our study. The prevalence of variants of uncertain significance in CHEK2 was found to be 7.3% (n= 7) in BRCA1/2 and PALB2 mutation negative Turkish patients with early-onset breast and/or ovarian cancer. Discussion/Conclusion: The present study may shed light on alternative variations that could be significant for understanding the prevalence and clinical suitability of the CHEK2 gene.

Application of heteroduplex analysis for CALR mutation screening detection in patients with Ph-myeloproliferative neoplasms

Background. In accordance with the World health organization clinical guidelines, the analysis of somatic mutations in the CALR gene, as well as mutations in the JAK2 and MPL genes, are included in the list of criteria for the Ph-myeloproliferative neoplasms diagnosis.More than 50 different mutation variants have been found in the CALR gene, among which the most frequent are a 52 bp deletion (c.1092_1143del), also called type 1, and a 5 bp insertion (c.1154_1155insTTGTC), also called type 2 (88 %).The remaining 12 % are other type less frequent indels or combinations thereof.It is most convenient to use sequencing methods to identify all possible variants of CALR mutations. It is also important to develop inexpensive screening test that can detect any mutations in the analyzed DNA fragment of CALR gene. This method can be heteroduplex analysis followed by electrophoresis on polyacrylamide gel (PAGE).The objective: to develop and demonstrate the feasibility of using heteroduplex analysis with separation of the PCR product by electrophoresis on non-denaturing PAGE for the CALR exon 9 mutations detection as the screening test. Materials and methods. DNA samples of 13 CALR-positive patients with different phenotypic variants of Ph-myeloproliferative neoplasms were screened by heteroduplex analysis. For the most common variants of CALR mutations (c.1092_1143del and c.1154_1155insTTGTC), a threshold determination of the mutant allele presence was analyzed.Nucleotide sequence of exon 9 fragment was determined using Sanger sequencing. Also, all 13 samples were analyzed using the pyrosequencing method to assess the allelic burden level.Results. Heteroduplex analysis revealed mutations in exon 9 of the CALR gene in all 13 patients. The threshold determinations of the method in the case of the c.1154_1155insTTGTC and c.1092_1143del analysis are 6.25 % and 3.13 % of the mutant allele presence in the patient sample, respectively.Conclusion. The proposed variant of the heteroduplex analysis with separation of the PCR product by electrophoresis on non-denaturing PAGE can be recommended for use as the preliminary screening test which is carried out before the confirming sequencing methods for the different indels (or combinations thereof) CALR mutations determine.The presence of heteroduplexes indicates the presence of a mutation, even if the mutant product is not visualized (in case of small mutations).

Somatic mosaicism in neurofibromatosis type 1

Актуальность. Нейрофиброматоз первого типа является одним из наиболее распространенных моногенных заболеваний. Этиологическим фактором его развития является патогенная мутация в гене NF1. Однако у части пациентов не удается достичь молекулярно-генетического подтверждения клинического диагноза. Мы полагаем, что в некоторых случаях это может быть обусловлено соматическим мозаицизмом с малой долей клеток, несущих патогенный аллель, в анализируемом образце биологического материала. Аллели с низкой представленностью отсеиваются общепринятыми фильтрами программного обеспечения при поиске генетических вариантов методом высокопроизводительного параллельного секвенирования (ВПС) и/или не детектируются визуально за счет слияния с фоновым шумом при анализе результатов секвенирования по Сэнгеру. Цель. Поиск патогенных мозаичных генетических вариантов у пациентов с нейрофиброматозом первого типа без выявленных стандартными методами герминальных мутаций в гене NF1. Материалы и методы. Исследование проведено на материале ДНК лимфоцитов периферической крови 275 пациентов, объединенных клиническим диагнозом нейрофиброматоз первого типа и отсутствием герминальных мутаций в генах NF1 и NF2 по результатам стандартных лабораторных исследований. Поиск точковых мутаций осуществляли методом ВПС на платформе Ion Torrent. Дизайн панели праймеров включал экзоны, прилегающие к ним интронные сегменты (20-70 п.н.), а также 3’UTR и 5’UTR генов NF1 и NF2. Исключение протяженных делеций в NF1 и NF2 осуществляли методом MLPA. С целью поиска мозаичных генетических вариантов был разработан и проведен углубленный анализ данных ВПС, основанный на биоинформатических и статистических подходах. Для верификации выявленных мозаичных патогенных генетических вариантов использовали секвенирование ДНК по Сэнгеру и гетеродуплексный анализ. Результаты. Патогенные соматические мутации в гене NF1 выявлены в 12 из 275 образцов (4,4%) ДНК больных, у которых были исключены герминальные мутации. В 8 образцах наличие мутантного аллеля было подтверждено альтернативными методами. Выводы. ДНК-диагностика доминантно наследуемых заболеваний требует особых подходов, учитывающих явление соматического мозаицизма. Предложенный метод позволяет выявить генетические варианты, представленные с малой аллельной частотой, без увеличения глубины секвенирования исследуемого образца и может быть применен для ретроспективного анализа данных ВПС с целью повышения качества ДНК-диагностики. Background. Neurofibromatosis type 1 is one of the most common monogenic disorders. A pathogenic mutation in NF1 is the etiological factor of neurofibromatosis type 1. Nevertheless, not all patients receive molecular genetic verification of the clinical diagnosis. We believe that this may be due to a somatic mosaicism with a small fraction of pathogenic allele, which is neglected by the NGS analysis software and/or is undetectable by Sanger sequencing due to noisy background. Objective. To detect pathogenic mosaic mutations in cases of neurofibromatosis type 1 without germline genetic variants. Material and methods. Two hundred seventy five peripheral blood lymphocyte DNA samples from patients with NF1 and without germline mutation were retrospectively analyzed. DNA samples were sequenced with Ion PGM and Ion S5 NGS systems. Gene panel design included NF1 and NF2 genes: exons, adjacent intron segments (20-70 b.p.), 3’UTRs and 5’UTRs. Samples were also tested using MLPA in order to exclude deletions in NF1 and NF2. We developed and implemented the pipeline to search mosaic cases using bioinformatics approaches. All newly detected mutations were evaluated by Sanger sequencing and by heteroduplex analysis. Result. We have identified new pathogenic mutations in NF1 for 12 patients (4.4%) and verified 8 of them using alternative methods. Conclusion. Dominant disorders, like neurofibromatosis type 1, require a detailed bioinformatic analysis of NGS results with respect to somatic mosaicism. Our approach makes it possible to identify genetic variants with low representation of a pathogenic allele without increasing the sequencing depth of the sample under study and can be used for retrospective analysis of NGS data in order to improve the quality of DNA diagnostics.

Εξατομίκευση της θεραπείας με υδροξυουρία ασθενών με β-αιμοσφαιρινοπάθειες

Ο κλινικός φαινότυπος των ασθενών με β-αιμοσφαιρινοπάθειες ποικίλλει, γεγονός που οφείλεται αφενός στις μεταλλάξεις που εντοπίζονται στο γονίδιο που κωδικοποιεί τη β-αλυσίδα της αιμοσφαιρίνης HbΑ και αφετέρου σε τροποποιητικά γονίδια που κωδικοποιούν σημαντικούς μεταγραφικούς παράγοντες που δρούν in trans ως προς το σύμπλεγμα των γονιδίων της β-σφαιρίνης, ρυθμίζοντας την έκφραση των γονιδίων του. Μελέτες έχουν δείξει ότι η αυξημένη παραγωγή της εμβρυϊκής αιμοσφαιρίνης μπορεί να βελτιώσει την κλινική εικόνα των ενήλικων ασθενών με β-αιμοσφαιρινοπάθειες. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή προσδιορίστηκαν οι μεταλλάξεις και οι γενετικές παραλλαγές, αφ’ενός στο γονίδιο της β-σφαιρίνης και αφ’ετέρου στα τροποποιητικά γονίδια FLT1, ARG2, NOS2A, KLF10, MAP3K5, PDE7B, ASS1, NOS1 και TOX που δρουν in trans και εμπλέκονται και στη ρύθμιση της έκφρασης των γονιδίων της γ-σφαιρίνης σε ενήλικες ασθενείς με β-αιμοσφαιρινοπάθειες. Μελετήθηκαν ενήλικες ασθενείς ελληνικής καταγωγής και συγκεκριμένα, 38 ασθενείς με εξαρτώμενη μεταγγίσεων β-θαλασσαιμία, 7 ασθενείς με μη εξαρτώμενη μεταγγίσεων β-θαλασσαιμία, 42 ασθενείς με μικροδρεπανοκυτταρική αναιμία και 53 υγιή άτομα, ως μάρτυρες. Στους μικροδρεπανοκυτταρικούς ασθενείς χορηγείται υδροξυουρία προκειμένου να αυξήσουν τα επίπεδα της εμβρυϊκής τους αιμοσφαιρίνης και κατά συνέπεια να βελτιώσουν τον κλινικό τους φαινότυπο. Παρ’ όλα αυτά δεν ανταποκρίνονται όλοι οι ασθενείς σε αυτή τη φαρμακευτική αγωγή. Ο σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν η μελέτη (φαρμακο)γονιδιωματικών δεικτών. Η παρουσία αυτών των δεικτών σχετίζεται με τη δυνατότητα α) των ασθενών με β-θαλασσαιμία να παράγουν υψηλά επίπεδα HbF, απουσία του HPFH συνδρόμου, εμφανίζοντας φαινότυπο μη εξαρτώμενης μεταγγίσεων β-θαλασσαιμίας–ενδιάμεση β-θαλασσαιμία ή ασθενών που δεν έχουν αυτή τη δυνατότητα εμφανίζοντας κλινικό φαινότυπο βαριάς β-θαλασσαιμίας εξαρτώμενη από μεταγγίσεις και β) των μικροδρεπανοκυτταρικών ασθενών να ανταποκρίνονται στη θεραπευτική αγωγή με υδροξυουρία. Απώτερος στόχος της παρούσας μελέτης ήταν και η επιβεβαίωση των συγκεκριμένων γενετικών παραλλαγών στα προαναφερθέντα τροποποιητικά γονίδια ως φαρμακογονιδιωματικών δεικτών, συμπεριλαμβάνοντας και αποτελέσματα προηγούμενων μελετών του εργαστηρίου Ε.Φ.Ε.Θ, προκειμένου να αυξηθεί το στατιστικό δείγμα και η εγκυρότητα των αποτελεσμάτων. Ο προσδιορισμός των μεταλλάξεων του γονιδίου της β-σφαιρίνης έγινε με ενίσχυση του γονιδίου με αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης (PCR) και ακολούθως αλληλούχηση κατά Sanger. Οι γενετικές παραλλαγές προσδιορίστηκαν είτε με αλληλούχηση κατά Sanger, είτε με κατάτμηση με συγκεκριμένα ένζυμα περιορισμού ή με εφαρμογή της μεθόδου ανάλυσης των ετεροδιμερών (Heteroduplex Analysis, HDA), αφού είχε προηγηθεί ενίσχυση με PCR των συγκεκριμένων τμημάτων των τροποποιητικών γονιδίων που φέρουν τις συγκεκριμένες γενετικές παραλλαγές, είτε με την εφαρμογή της αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυμεράσης ειδικής για το αλληλόμορφο (Allele Specific PCR).Τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης ανέδειξαν σημαντική συσχέτιση μεταξύ της μικρής επαναλαμβανόμενης εν σειρά αλληλουχίας - STR-5’-GCGCG-3’ στον υποκινητή του MAP3K5 γονιδίου με την ανταπόκριση στη θεραπεία με υδροξυουρία των ασθενών με μικροδρεπανοκυτταρική αναιμία. Επίσης, σημαντική συσχέτιση βρέθηκε μεταξύ των μονονουκλεοτιδικών πολυμορφισμών rs944725 στο NOS2A γονίδιο και rs10483801 στο ARG2 γονίδιο, με την ανταπόκριση στη θεραπεία με υδροξυουρία των ασθενών με μικροδρεπανοκυτταρική αναιμία. Επιπλέον, βρέθηκε ισχυρή συσχέτιση των μονονουκλεοτιδικών πολυμορφισμών rs2182008 στο FLT1 γονίδιο, του rs3191333 στο KLF10 γονίδιο και του rs10483801 στο ARG2 γονίδιο με το φαινότυπο ενδιάμεσης β-θαλασσαιμίας που εμφανίζουν οι ασθενείς με μη εξαρτώμενη μεταγγίσεων β-θαλασσαιμία, οι οποίοι έχουν την ικανότητα να παράγουν αυξημένα επίπεδα εμβρυϊκής αιμοσφαιρίνης, απουσία του HPFH συνδρόμου, βελτιώνοντας τον κλινικό τους φαινότυπο.

Implementation of Microfluidic Chip Electrophoresis for the Detection of B-cell Clonality

Introduction:A clonal population of B-cells is defined as those cells arising from the mitotic division of a single somatic cell with the same rearrangement of immunoglobulin genes. This gives rise to DNA markers for each individual lymphoid cell and its progenies and enables us to study clonality in different B-cell malignancies using multiplex polymerase chain reaction - PCR. The BIOMED-2 protocol has been implemented for clonality detection in lymphoproliferative diseases and exploits multiplex PCR reaction, subsequently analyzed by heteroduplex analysis (HDA) using polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE). With the advent of miniaturization and automation of molecular biology methods, lab-on-chip technologies were developed and replace partially the conventional approaches. We tested device for microfluidic chip, which is used for B-cells clonality analysis, using a PCR reaction for three subregions called frameworks (FR) of the immunoglobulin heavy locus (IGH) gene.Material and Methods:For the implementation and comparison of the two methods we analyzed three unknown B-cell chronic lymphocytic leukemia (B-CLL) samples. As positive control (PK) we used one formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) sample from B-CLL lymph node. The DNA was extracted from FFPE sections and multiplex PCR was used to amplify IGH gene segments. After PCR, the HDA was performed, the DNA fragments were evaluated on the PAGE and the microfluidic chip electrophoresis as well, and the results were compared.Results:Using HDA with subsequent PAGE, we were able to confirm the clonality of the positive control and the tested samples. The same results were obtained by the Bioanalyzer 2100. The microfluidic chip electrophoresis was persuasive in all tested samples.Conclusion:The implementation of microfluidic chip electrophoresis for detection of B-cell clonality by BIOMED-2 protocol on the device Agilent 2100 Bioanalyzer was successful and yielded the same results as the HDA - PAGE. Moreover, chip electrophoresis system is faster for preparation and less laborious than the conventional HDA - PAGE method.