Το φυτό Crocus sativus (Κρόκος Κοζάνης) είναι ένα ανθοφόρο είδος του γένους Crocus που ανήκει στην οικογένεια Iridaceae. Το σαφράν είναι τα αποξηραμένα στίγματα του φυτού Crocus sativus L. και συγκαταλέγεται ανάμεσα στα πιο ακριβά μπαχαρικά του κόσμου. Κυρίως χρησιμοποιείται σαν φάρμακο της παραδοσιακής ιατρικής καθώς και ως αρωματικό και χρωστική τροφίμων στην καθημερινή ζωή. Στα κυριότερα συστατικά του σαφράν περιλαμβάνονται οι κροκίνες, οι οποίες είναι μονο- και δις-εστέρες κροκετίνης με γλυκόζη ή/και γεντιοβιόζη. Το σαφράν θεωρείται δυνητικό όπλο ενάντια στις νευροεκφυλιστικές ασθένειες αφού οι ουσίες που περιέχει (κροκίνη, κροκετίνη και σαφρανάλη) έχουν δείξει αξιοσημείωτη αντιοξειδωτική δράση. Επιπλέον, ο κρόκος έχει παρουσιάσει σημαντική δραστικότητα έναντι της νόσου του Πάρκινσον και του Αλτσχάιμερ. Ο κεντρικός σχεδιασμός της τρέχουσας μελέτης ήταν η απομόνωση από τον κρόκο της πιο άφθονης κροκίνης, trans-crocin-4 (TC4) σε επαρκείς ποσότητες προκειμένου να πραγματοποιηθεί μια Φαρμακοκινητική μελέτη σε ποντίκια και στη συνέχεια να εκτιμηθεί η βιοδιαθεσιμότητα της TC4, σε πλάσμα ποντικών μετά από ενδοπεριτοναϊκή (i.p.) χορήγηση καθώς και η ικανότητά της να διασχίσει τον αιματοεγκεφαλικό φραγμό (ΑΕΦ). Ο τελικός στόχος αυτής της μελέτης ήταν να διερευνηθούν οι μεταβολές στο μεταβολικό δακτυλικό αποτύπωμα μετά τη χορήγηση της TC4 και να εντοπιστούν τα χαρακτηριστικά που μεταβλήθηκαν σημαντικά.Αρχικά, αυτή η μελέτη παρουσιάζει μια απλή και αποτελεσματική μέθοδο απομόνωσης σε ένα βήμα των κύριων δευτερογενών μεταβολιτών ενός εκχυλίσματος κρόκου με μεθανόλη-νερό 50:50 v/v χρησιμοποιώντας χρωματογραφία κατανομής με φυγοκέντρηση (Centrifugal Partition Chromatography-CPC) που εκτελέστηκε τόσο σε dual-mode όσο και σε elution extrusion mode, χρησιμοποιώντας πέντε διφασικά συστήματα διαλυτών. Συνολικά, από όλα τα πειράματα CPC που πραγματοποιήθηκαν, απομονώθηκαν 6185 mg καθαρής TC4 ενώ απομονώθηκαν και χαρακτηρίστηκαν 15 επιμέρους συστατικά του εκχυλίσματος του σαφράν. Συνεπώς, η μεθοδολογία CPC που αναπτύχθηκε, θεωρήθηκε κατάλληλη προσέγγιση για την ανάλυση του σαφράν τόσο στο εργαστήριο όσο και στη βιομηχανία των φυσικών προϊόντων.Το επόμενο βήμα της τρέχουσας μελέτης περιελάμβανε την ανάπτυξη και την πλήρη επικύρωση δύο μεθοδολογιών με χρήση υγρής χρωματογραφίας υπερυψηλής απόδοσης (Ultra High Performance Liquid Chromatography–UHPLC PDA), σύμφωνα με τις οδηγίες των U.S FDA και EMA, για την ταχεία και ακριβή ποσοτικοποίηση της TC4 και της κροκετίνης (CRC) σε πλάσμα και εγκέφαλο ποντικιών μετά από i.p. χορήγηση. Οι δύο μέθοδοι UPLC PDA εφαρμόστηκαν επιτυχώς για τον προσδιορισμό των CRC και TC4 σε πλάσμα και εγκέφαλο ποντικιών μετά από i.p. χορήγηση TC4 (50 και 150 mg/kg) σε χρονικό διάστημα 0 240 λεπτών. Η επιλογή της i.p. οδού χορήγησης εξυπηρετούσε την παράκαμψη του μεταβολισμού πρώτης διόδου ή/και της γαστρικής υδρόλυσης, γεγονός που ενίσχυσε τη βιοδιαθεσιμότητα της TC4. Επιπλέον, διαπιστώθηκε ότι η TC4 ήταν ικανή να διασχίσει τον ΑΕΦ και να αυξήσει τα επίπεδά της στον εγκέφαλο ανεξάρτητα από τον ιδιαίτερα υδρόφιλο χαρακτήρα της. Είναι ενδιαφέρον ότι η CRC δεν ανιχνεύθηκε σε κανένα δείγμα πλάσματος ή εγκεφάλου, αν και έχει αναφερθεί ότι η TC4 υδρολύεται γρήγορα σε CRC μετά από χορήγηση από το στόμα. Συνεπώς η i.p. χορήγηση θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί στην περίπτωση της TC4 ώστε να είναι εφικτός ο ακριβής προσδιορισμός του βιολογικού της ρόλου.Στο τελευταίο στάδιο της τρέχουσας μελέτης, το μεταβολικό δακτυλικό αποτύπωμα και οι σχετικές μεταβολές του μετά την i.p. χορήγηση της TC4 σε αρσενικά και θηλυκά ποντίκια, προσδιορίστηκε με μεταβολομική μελέτη βασισμένη σε φασματομετρία μάζας συζευγμένη με υγροχρωματογραφία υπερυψηλής απόδοσης (UHPLC-HRMS). Στη συνέχεια εφαρμόστηκε πολυπαραμετρική στατιστική ανάλυση (MVA), με σκοπό να προσδιορισθούν τυχόν επιδράσεις της TC4 στο μεταβόλωμα των ποντικιών. Λόγω της μεγάλης μεταβλητότητας που επιβάλλεται από διάφορους παράγοντες, π.χ. το φύλο, η δόση χορήγησης και τα χρονικά σημεία, η ML-(s)PLS-DA αποδείχθηκε η μόνη αποτελεσματική προσέγγιση. Επιπλέον, ανιχνεύθηκε μια φυλοσύνδετη πρωταρχική επίδραση στο μεταβόλωμα των ζώων, υποδηλώνοντας ότι η χορήγηση και στα δύο φύλα είναι απαραίτητη προκειμένου να έχουμε σαφή εικόνα των μεταβολικών αλλαγών. Τέλος, με αυτή τη UPLC-HRMS μεθοδολογία, καταδείχθηκε σαφώς ότι η χρονική αλληλουχία των μεταβολών στο μεταβόλωμα οφειλόταν στη χορήγηση TC4. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα που παρήχθησαν από διάφορα στατιστικά λογισμικά, οι επιλεγμένες μεταβλητές εφαρμόστηκαν περαιτέρω σε ηλεκτρονικές βάσεις δεδομένων, ώστε να ταυτοποιηθούν και να εντοπιστούν πιθανοί μεταβολίτες.
UHPLC Analysis of Saffron (Crocus sativus L.): Optimization of Separation Using Chemometrics and Detection of Minor Crocetin Esters
