Estudios biológicos e inmunológicos de aislamientos de Toxoplasma gondii provenientes de animales de zoológico en Argentina

Toxoplasma gondii es un parásito intracelular obligado que afecta a mamíferos y aves que posee un ciclo de vida indirecto. Su virulencia es variable de acuerdo con la susceptibilidad de la especie afectada y del genotipo involucrado en la infección. Los aislamientos de T. gondii se han identificado genéticamente a nivel mundial como “clonales” denominándose tipo I, II y III. Sin embargo, en Sudamérica se ha encontrado la presencia de aislamientos no clonales o “atípicos”. El objetivo principal de este trabajo fue evaluar el comportamiento biológico de dos aislamientos de T. gondii, identificados genéticamente como atípicos, provenientes de los animales de zoológico Saimiri boliviensis (mono ardilla boliviano) y Macropus rufogriseus (walaby de Bennet), (denominados TgSb y TgMr, respectivamente) en Argentina y evaluar la respuesta inmune de ratones infectados experimentalmente con estos. Se realizó la genotipificación de 29 muestras de ADN de T. gondii de Argentina mediante nPCR-RFLP para 10 marcadores moleculares. Con los resultados obtenidos se realizó una red filogenética utilizando el software SplitsTree4. Se evaluaron los aislamientos TgSb y TgMr en comparación con las cepas de referencia RH, ME49 y VEG (tipos clonales I, II y III respectivamente) en un ensayo in vitro. Se realizaron seis ensayos independientes (tres de 6 h de duración y tres de 18 h de duración) con tres réplicas cada uno. A continuación, se realizó inmunofluorescencia indirecta sobre los cubreobjetos para contar la cantidad de vacuolas parasitóforas (invasión) y la cantidad de taquizoítos dentro de cada vacuola (replicación). Para evaluar la morbi-mortalidad se utilizaron ratones Swiss (n = 30) y se distribuyeron en 5 grupos inoculados con taquizoítos (dosis de infección 102 y 103) de TgSb y TgMr, las cepas ME49 y VEG y control negativo. Se evaluó la respuesta inmune celular por medio del cultivo de células esplénicas y desafío de los cultivos con antígeno de lisado total parasitario (TLA) producido a partir de las cepas RH, ME49, VEG y de los aislamientos TgSb y TgMr. Los sobrenadantes se analizaron con un kit de ELISA para la detección de IFN- Ꝩ murino. Se identificaron 17 genotipos diferentes en Argentina, incluyendo 5 “nuevos” e incorporados a la base de datos ToxoDB (# 283, # 284, # 285, # 286, y # 287). La caracterización molecular completa de TgSb y TgMr confirmó su condición de atípicos siendo identificados como genotipos # 163 y # 14, respectivamente. Los resultados in vitro indicaron que los aislamientos TgMr y TgSb tienen un comportamiento más virulento que las cepas ME49 y VEG con semejanzas al tipo clonal virulento RH en su baja capacidad de invasión (TgMr) como en su alta capacidad de replicación (TgSb). La replicación y la velocidad de duplicación serían los factores más importantes para evaluar en estudios in vitro como indicadores de virulencia. Se estableció un índice in vitro de invasión – replicación y el resultado demostró que RH, TgSb y TgMr presentaron los menores valores, que se asociaron inversamente con la mayor virulencia. Ambos aislamientos presentaron una morbi-mortalidad del 100 %, teniendo una virulencia mayor que las cepas de referencia II y III. Considerando los bajos índices invasion – replicación de TgSb y TgMr se postula la presencia y expresión de otros factores que se relacionen con su elevada virulencia. El estímulo con TLA de RH indujo la producción de niveles significativamente altos de IFN- Ꝩ en los sobrenadantes de los ratones infectados con los aislamientos TgMr y TgSb, indicando la presencia de una respuesta inmune adaptativa con la producción de linfocitos específicos orientados hacia un perfil Th1. La sobre producción de esta citoquina podría relacionarse con la expresión/secreción de moduladores de la respuesta inmune por parte de estos protozoos y se vincularía con la mayor virulencia detectada en el modelo in vivo. Ambos genotipos (# 163 y # 14) presentaron un fenotipo de alta virulencia, tanto in vitro como in vivo, aunque se agruparon en la red filogenética en cercanías del tipo clonal III. Por lo dicho anteriormente, se propone el uso de estudios in vitro previo al estudio in vivo para minimizar la utilización de animales en estudios de caracterización de aislamientos de T. gondii. El establecimiento de un índice in vitro de invasión-replicación podría ser de utilidad para predecir virulencia de modo indirecto: bajo valor del índice se relaciona con alta virulencia (morbi-mortalidad) en modelo murino. La respuesta Th1 con sobre producción de IFN- Ꝩ sería el mecanismo preponderante en infecciones con genotipos virulentos.