Translationskopplung via Termination-Reinitiation in Archaea und Bacteria

Operons wurden zuerst im Jahre 1961 beschrieben. Bis heute ist bekannt, dass die prokaryotischen Domänen Bacteria und Archaea Gene sowohl in monocistronischen als auch in bi- oder polycistronischen Transkripten exprimieren können. Häufig überlappen Gene sogar in ihren Sequenzen. Diese überlappenden Genpaare stehen nicht in Korrelation mit der Kompaktheit ihres Genoms. Das führt zu der Annahme, dass eine Art der Regulation vorliegt, welche weitere Proteine oder Gene nicht benötigt. Diese könnte eine gekoppelte Translation sein. Das bedeutet die Translation des stromabwärts-liegenden Gens ist abhängig von der Translation eines stromaufwärts-liegenden Gens. Diese Abhängigkeit kann zum Beispiel durch lang reichende Sekundärstrukturen entstehen, bei welchen Ribosomenbindestellen (RBS) des stromabwärts-liegenden Gens blockiert sind. Die de novo-Initiation am stromabwärts-liegenden Gen kann nur stattfinden, wenn das erste Gen translatiert wird und dabei die Sekundärstruktur an der RBS aufgeschmolzen wird. Für Genpaare in E. coli ist dieser Mechanismus gut untersucht. Ein anderes Beispiel für die Translationskopplung ist die Termination-Reinitiation, bei welcher ein Ribosom das erste Gen translatiert bis zum Stop-Codon, dort terminiert und direkt am stromabwärts-liegenden Start-Codon reinitiiert. Der Mechanismus via Termination-Reinitiation ist bis jetzt nur für eukaryontische Viren beschrieben worden. Im Gegensatz zu einer Kopplung über Sekundärstrukturen kommt es bei der Termination-Reinitiation am stromabwärts-liegenden Gen nicht zu einer de novo-Initiation sondern eine Reinitiation des Ribosoms findet statt. Diese Arbeit analysiert jene Art der Translationskopplung an Genen polycistronischer mRNAs in jeweils einem Modellorganismus als Vertreter der Archaea (Haloferax volcanii) und Bacteria (Escherichia coli). Hierfür wurden Reportergenvektoren erstellt, welche die überlappenden Genpaare an Reportergene fusionierten. Für diese Reportergene ist es möglich die Transkriptmenge zu quantifizieren sowie für die exprimierten Proteine Enzymassays durchgeführt werden können. Aus beiden Werten können Translationseffizienzen berechnet werden indem jeweils die Enzymaktivität pro Transkriptmenge ermittelt wird. Durch ein prämatures Stop-Codon in diesen Konstrukten ist es möglich zu unterscheiden ob es für die Translation des zweiten Gens essentiell ist, dass das Ribosom den Überlapp erreicht. Hiermit konnte für neun Genpaare in H. volcanii und vier Genpaare in E. coli gezeigt werden, dass eine Art der Kopplung stattfindet bei der es sich um eine Termination-Reinitiation handelt. Des Weiteren wurde analysiert, welche Auswirkungen intragene Shine-Dalgarno Sequenzen bei dem Event der Translationskopplung besitzen. Durch die Mutation solcher Motive und dem Vergleich der Translationseffizienzen der Konstrukte, mit und ohne einer SD Sequenz, wird für alle analysierten Genpaare beider Modellorganismen gezeigt, dass die SD Sequenz einen Einfluss auf diese Art der Kopplung hat. Zwischen den Genpaaren ist dieser Einfluss jedoch stark variabel. Weiterhin wurde der maximale Abstand zwischen zwei bicistronischen Genen untersucht, für welchen Translationskopplung via Termination-Reinitiation noch stattfinden kann. Hierfür wird durch site-directed mutagenesis jeweils ein prämatures Stop-Codon im stromaufwärts-liegenden Gen eingebracht, welches den intergenen Abstand zwischen den Genen in den jeweiligen Konstrukten vergrößert. Der Vergleich aller Konstrukte eines Genpaars zeigt in beiden Modellorganismen, dass die Termination-Reinitiation vom intergenen Abstand abhängig ist und die Translationseffizienz des stromabwärts-liegenden Reporters bereits ab 15 Nukleotiden Abstand abnimmt. Eine weitere Fragestellung dieser Arbeit war es, den genauen Mechanismus der Termination-Reinitiation zu analysieren. Für Ribosomen gibt es an der mRNA nach der Termination der Translation zwei Möglichkeiten: Entweder als 70S Ribosom bestehen zu bleiben und ein weiteres Start-Codon auf der mRNA zu suchen oder in seine beiden Untereinheiten zu dissoziieren, während die 50S Untereinheit die mRNA verlässt und die 30S Untereinheit über Wechselwirkungen an der mRNA verbleiben kann. Um diesen Mechanismus auf molekularer Ebene zu untersuchen, wird ein Versuchsablauf vorgestellt. Dieser ermöglicht das Event bei der Termination-Reinitiation in vitro zu analysieren. Eine Unterscheidung von 30S oder 70S Ribosomen bei der Reinitiation der Translation des stromabwärts-liegenden Gens wird ermöglicht. Die Idee dabei basiert auf einem ribosome display, bei welchem Translationskomplexe am Ende der Translation nicht in ihre Bestandteile zerfallen können, da die eingesetzte mRNA kein Stop-Codon enthält Der genaue Versuchsablauf, die benötigten Bestandteile sowie proof-of-principal Versuche sind in der Arbeit dargestellt und mögliche Optimierungen werden diskutiert.

La présentation sur ribosome

La présentation sur ribosome (en anglais, ribosome display) est une méthode d’évolution moléculaire et de sélection de banques peptidiques et protéiques. Le ribosome display est réalisé in vitro dans un milieu acellulaire et repose sur la formation d’un complexe ternaire ribonucléoprotéique entre l’ARN, le ribosome et la protéine. Le ribosome display est devenu de nos jours l’une des méthodes de présentation les plus utilisées. Elle a notamment permis le criblage et la sélection de peptides, de protéines, d’échafaudages moléculaires afin d’améliorer leur affinité, leur spécificité, leur activité catalytique ou même leur stabilité. Cette revue présente la mise en œuvre du ribosome display et les applications qui découlent de l’utilisation de cette technologie.

Ribosome Display Technology: Applications in Disease Diagnosis and Control

Antibody ribosome display remains one of the most successful in vitro selection technologies for antibodies fifteen years after it was developed. The unique possibility of direct generation of whole proteins, particularly single-chain antibody fragments (scFvs), has facilitated the establishment of this technology as one of the foremost antibody production methods. Ribosome display has become a vital tool for efficient and low-cost production of antibodies for diagnostics due to its advantageous ability to screen large libraries and generate binders of high affinity. The remarkable flexibility of this method enables its applicability to various platforms. This review focuses on the applications of ribosome display technology in biomedical and agricultural fields in the generation of recombinant scFvs for disease diagnostics and control.

Abstract WP313: Liposomes With Anti-Fibrin Protein Binders to Target Clot in Stroke

Introduction: Direct clot targeting represents attractive concept for clot imaging as well as targeted delivery of drugs, e.g. thrombolytics. Small protein binders attached to nanoliposomes may target thrombi and deliver drugs although selective affinity to fibrin and not fibrinogen is the main challenge. Methods: For identification and preparation of fibrin-specific artificial protein binders derived from scaffolds of albumin-binding domain (ABD) of streptococcal protein G, a highly complex ABD-derived combinatorial library in combination with ribosome display selection was used. In vitro models were used to document delivery of nanoliposomes to human thrombi. Results: A recombinant target as a stretch of three identical fibrin fragments of 16 amino acid peptides of the Bβ chain fused to TolA protein carrying polyhistidylated tag and Avitag was constructed. Ribosome display was followed by large-scale ELISA screening of protein binders. Only four protein variants had selective affinity to human fibrin - see figure 1A. The most selective, variant D7, was modified by C-terminal FLAG/His 6 or His 6 /His 6 tag in order to be attached onto the surface of nanoliposomes. The electron microscopy then confirmed the structure of nanoliposome-binder particles. Isothermal titration calorimetry provided dissociation constant for liposome-binder metallochelating bond in the range 10 -7 to 10 -9 for mono- and double-HisTag forms. In vitro, in silicone replica of small diameter artery, the confocal and scanning electron microscopy confirmed a successful binding of D7-attached- to-nanoliposomes to fibrin fibres, see figure 1B. Conclusions: We developed binders relatively selective to fibrin, attached them to nanoliposomes, and documented targeting of fibrin in vitro. As the next step, selectivity needs to be now documented in animal studies.

More than one way to bind to cholesterol: atypical variants of membrane-binding domain of perfringolysin O selected by ribosome display

By using developed ribosomal display, we discovered variants of perfringolysin O, a pore forming toxin from bacteria Clostridium perfringens, with non-conserved amino acid substitutions at regions crucial for cholesterol recognition.