Die Rolle des S1P-Rezeptors S1P5, des S1P-Transporters Spinster 2 und der kettenlängenspezifischen Ceramide bei Nierenfibrose

Es ist bekannt, dass die Aktivierung von S1P-Rezeptoren die Expression von profibrotischen Mediatoren, wie dem Bindegewebswachstumsfaktor CTGF, induzieren und deshalb auch eine Rolle bei der Entstehung der Nierenfibrose spielen kann. In diesem Kontext konnte unsere Arbeitsgruppe zeigen, dass die Aktivierung von S1P5 zur TGF-β2-induzierten CTGF-Expression in humanen glomerulären Mesangiumzellen beiträgt (Wünsche et al. 2015). Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurde deshalb die Rolle von S1P5 in einem in vivo-Modell zur Nierenfibrose untersucht. Männliche S1P5-/--Mäuse und Wildtypmäuse mit C57BL/6J-Hintergrund wurden mit einer adeninreichen Diät für jeweils 7 und 14 Tage gefüttert, um eine tubulointerstitielle Fibrose hervorzurufen. Die Nieren von unbehandelten Mäusen des jeweiligen Genotyps dienten als Kontrolle. Die Ergebnisse zeigen, dass S1P5-/--Mäuse geringere Kreatininplasmaspiegel und weniger Schäden im Nierengewebe gegenüber Wildtypen zeigten. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass die mRNA-Expression von mehreren Fibrosemarkern und proinflammatorischen Zytokinen in den S1P5-/--Mäusen schwächer war als in den Wildtypen. Die Auswertung von histochemischen Färbungen und Western Blots bestätigte diese Beobachtung. Zusammengefasst kann festgehalten werden, dass S1P5 eine wichtige Rolle bei der Entstehung von Adenin-induzierter Entzündung in der Niere und nachfolgender Pathogenese wie Gewebeschäden und Fibrose spielt. Ceramide sind ein Bestandteil der Lipiddoppelschicht, in allen eukaryotischen Zellen vorhanden und zentrale Moleküle des Sphingolipidstoffwechsels. Die Synthese und der Abbau der Ceramide werden von vielen verschiedenen Enzymen reguliert. Neben ihrer Aufgabe als strukturelle Elemente der Zellmembranen wurde herausgefunden, dass Ceramide auch in verschiedenen Signalwegen involviert sind, die auch bei Nierenerkrankungen eine Rolle spielen. In Bezug auf die Kettenlänge der angehängten Fettsäure können so genannte kurz- und langkettige Ceramide Apoptose induzieren, wohingegen sehr langkettige Ceramide Zellproliferation fördern. In mehreren Studien wurden bereits Konzentrationsänderungen von kettenlängenspezifischen Ceramiden im Plasma und Serum von Patienten gemessen, die zu diesem Zeitpunkt an einer Nierenerkrankung litten. In dieser Arbeit wurde daher untersucht, ob solche Konzentrationsänderungen auch im Nierengewebe von Patienten und Mäusen mit einer Nierenfibrose, dem Kennzeichen nahezu aller chronischen Nierenerkrankungen, zu sehen sind. Zu diesem Zwecke wurden Biopsien der Nierenrinde und des Nierenmarks von fibrotischen Nieren aus Patienten, die an Hydronephrose und/oder Pyelonephritis litten, und von gesunden Gewebeproben untersucht. Letztere wurden durch Nephrektomien zur Behandlung von Nierenkarzinomen gewonnen und dienten als nichtfibrotische Kontrolle. Zum Vergleich mit fibrotischen Nieren aus Mäusen wurden männliche Mäuse der Linie C57BL/6J mit einer adeninreichen Diät für 14 Tage gefüttert. Die Konzentrationen der Sphingolipide wurden mittels Massenspektrometrie gemessen und die Level der fibrotischen Marker wurden mit Hilfe von RT-qPCR und histologischen Färbungen analysiert. Die Ergebnisse zeigen, dass die sehr langkettigen Ceramide Cer d18:1/24:0 und Cer d18:1/24:1 sowohl in fibrotischen Nierenrindenproben der Patienten als auch in fibrotischen Nieren der Mäuse im Vergleich zu den jeweiligen Kontrollproben signifikant geringer konzentriert waren. Diese Effekte korrelieren mit der Hochregulation der Fibrosemarker COL1α1, COL3α1 und αSMA in den fibrotischen Nieren. Es konnte gezeigt werden, dass nur bestimmte Ceramide in fibrotischem Nierengewebe in ihrer Konzentration verändert sind, was interessante Fragen hinsichtlich der Ursache dieser Veränderungen, ihrer funktionellen Aufgabe und zu möglichen Effekten einer Manipulation des Ceramidstoffwechsels mit dem Ziel der Behandlung der Nierenfibrose oder der Entdeckung neuer Biomarker aufwirft. Die hier präsentierten Ergebnisse zeigen zudem die Eignung von in vivo-Mausmodellen als translationalen Ansatz für das Verständnis der Beteiligung von Ceramiden in menschlichen Nierenerkrankungen. Die in vitro-Untersuchungen zu der Rolle des S1P-Transporters Spns2 haben gezeigt, dass Spns2 die Expression von CTGF nach Stimulation von Mausmesangiumzellen mit TFG-β2 verstärkt. 24 Stunden nach Stimulation war im Zellkulturüberstand von Spns2-/--mMC im Gegensatz zu Spns2+/+-mMC keine Akkumulation des pro-fibrotischen Zytokins CTGF gegenüber der unstimulierten Kontrolle detektierbar. Nach 48 Stunden Stimulation mit TFG-β2 war die Menge an CTGF im Zelllysat als auch im Zellkulturüberstand von Spns2-/--mMC genauso hoch wie in der unstimulierten Kontrolle. Im Zelllysat und im Überstand der Spns2-/--mMC war die Expression von CTGF weiterhin deutlich höher im Vergleich zu den Proben der unstimulierten Zellen. Die basale und TFG-β2-induzierte Genexpression von S1P-synthetisierenden und S1P-degradierenden Enzymen, sowie die Konzentrationen an S1P und Sphingosin in den Zellen unterschieden sich zwischen Spns2-/--mMC und Spns2+/+-mMC nicht.

Die Rolle von oxidativem Stress auf die Zellviabilität von epithelialen Lungenzellen bei Ataxia-teleangiectasia

Unter dem vielseitigen Symptomkomplex der autosomal-rezessiv vererbten Erkrankung Ataxia-teleangiectasia (A-T) nimmt die Lungenschädigung eine herausragende Rolle ein. Sie beeinflusst die Morbidität und Mortalität der Erkrankung durch rezidivierende Infekte, Bronchiektasien sowie akutes oder chronisches Lungenversagen nachhaltig. Als pathophysiologische Grundlage gilt oxidativer Stress mit einer erhöhten Sensitivität für reaktive Sauerstoffspezies (ROS) und DNA-schädigende Reagenzien. Das aus dem gleichnamigen Gen resultierende Protein ATM wird durch das Vorkommen von DNADoppelstrangbrüchen (DSB) und ROS auf verschiedene Arten aktiviert und reguliert anschließend diverse Prozesse wie der DNA-Reparatur und den zellulären Stressantwortmechanismen. Ziel dieser Arbeit war es die Sensitivität von ATM-defizienten Lungenzellen im Hinblick auf oxidativen Stress näher zu untersuchen. Hierfür wurden Atm-defiziente murine Lungenzellen spontan und nach Stimulation mit Bleomycin (BLM) auf ihre prozentuale Verteilung in der Lunge, auf den Level von ROS, ihre Viabilität und ROS-induzierte DNA-Schäden hin untersucht. Spontan zeigte sich ein signifikant erhöhtes Vorkommen von Alveolarepithelzellen vom Typ 2 (AT2-Zellen) in Atm-defizienten Mauslungen im Vergleich zu Wildtyp-Lungen, welches sich durch die Stimulation mit BLM noch verstärkte und auf erhöhte Regenerations- und Reparaturvorgänge in der Lunge hindeutet. Zudem ist der intrazelluläre Level an ROS in den Lungenzellen und AT2-Zellen signifikant erhöht. Mit steigenden Konzentrationen an BLM sank die Zellviabilität pulmonaler Atm-defizienter Zellen deutlich und die Resolution von DNA-Schäden ist im Vergleich zu Wildtyp-Zellen verzögert. Die Ergebnisse der Arbeit deuten auf eine Beteiligung von oxidativem Stress und DNA-Schäden als pathophysiologische Komponente bei der Entstehung der Lungenmanifestation bei A-T hin.

Erfolgreiche Zelltherapie mit virusspezifischen T-Zellen vom HLA-teilkompatiblen Drittspender bei disseminierter Adenovirus-Infektion früh nach allogener Stammzelltransplantation

ZusammenfassungAdenovirus-Infektionen (AdV-Infektionen) nach pädiatrischer hämatopoetischer Stammzelltransplantation sind häufig und treten in 10 – 20 % aller allogenen Transplantationen auf (bis 30 % der T-Zell-depletierten Transplantationen). Sie sind mit einer hohen Rate an Morbidität und Mortalität verbunden. Da die antivirale Therapie nur virostatisch wirkt und durch erhebliche Toxizität eine limitierende Behandlungsoption darstellt, ist die virusspezifische T-Zell-Therapie als sichere und gut verträgliche komplikationsarme Option sehr attraktiv. Unsere 4-jährige Patientin entwickelte 3 Wochen nach allogener hämatopoetischer Transplantation vom 10/10-HLA-passenden Registerspender eine disseminierte AdV-Infektion (Enteritis, persistierendes Fieber, Sepsis). Eine antivirale Therapie mit Cidofovir zeigte eine gute Wirksamkeit, musste aber wegen erheblicher Nephrotoxizität abgebrochen werden. Unter einer Überbrückungstherapie bis zur geplanten Gabe AdV-spezifischer T-Zellen mit Brincidofovir (BCV) stabilisierte sich die AdV-Last im Blut, blieb aber signifikant hoch. AdV-spezifische T-Zellen der HLA-haploidenten Mutter wurden nach Stimulation mit AdV-Hexon-Peptid-Gemisch über Interferon-γ-Zytokinsekretion (Interferon-γ: IFN-γ) und immunmagnetische Separation aufgereinigt und 1-malig in einem Frischpräparat mit einer Dosis von 2,5 × 104CD3+-Zellen/kg Körpergewicht verabreicht. Die Anwendung verlief komplikationslos und führte zu einer schnellen Elimination des Virus im Blut (ca. nach 2 Wochen). Nahezu zeitgleich (ca. 3 Wochen nach der AdV-spezifischen T-Zell-Gabe) konnten erstmals AdV-spezifische T-Zellen im Patientenblut nachgewiesen werden. Der adoptive Transfer AdV-spezifischer T-Zellen vom HLA-teilpassenden Familienspender als „Third-Party-Spender“ stellt eine rasch verfügbare und wenig toxische Behandlungsoption für Patienten mit refraktärer AdV-Erkrankung dar.

Erfolgreiche Zelltherapie mit virusspezifischen T-Zellen vom HLA-teilkompatiblen Drittspender bei disseminierter Adenovirusinfektion früh nach allogener Stammzelltransplantation

ZusammenfassungAdenovirusinfektionen (AdV-Infektionen) nach pädiatrischer hämatopoetischer Stammzelltransplantation sind häufig und treten in 10 – 20% aller allogenen Transplantationen auf (bis 30% der T-Zell-depletierten Transplantationen). Sie sind mit einer hohen Rate an Morbidität und Mortalität verbunden. Da die antivirale Therapie nur virostatisch wirkt und durch erhebliche Toxizität eine limitierende Behandlungsoption darstellt, ist die virusspezifische T-Zell-Therapie als sichere und gut verträgliche komplikationsarme Option sehr attraktiv. Unsere 4-jährige Patientin entwickelte 3 Wochen nach allogener hämatopoetischer Transplantation vom 10/10 HLA-passenden Registerspender eine disseminierte AdV-Infektion (Enteritis, persistierendes Fieber, Sepsis). Eine antivirale Therapie mit Cidofovir zeigte eine gute Wirksamkeit, musste aber wegen erheblicher Nephrotoxizität abgebrochen werden. Unter einer Überbrückungstherapie bis zur geplanten Gabe AdV-spezifischer T-Zellen mit Brincidofovir (BCV) stabilisierte sich die AdV-Last im Blut, blieb aber signifikant hoch. AdV-spezifische T-Zellen der HLA-haploidenten Mutter wurden nach Stimulation mit AdV-Hexon-Peptid-Gemisch über Interferon-γ-Zytokinsekretion (Interferon-γ: IFN-γ) und immunmagnetische Separation aufgereinigt und einmalig in einem Frischpräparat mit einer Dosis von 2,5 × 104 CD3+-Zellen/kg Körpergewicht verabreicht. Die Anwendung verlief komplikationslos und führte zu einer schnellen Elimination des Virus im Blut (ca. nach 2 Wochen). Nahezu zeitgleich (ca. 3 Wochen nach der AdV-spezifischen T-Zell-Gabe) konnten erstmals AdV-spezifische T-Zellen im Patientenblut nachgewiesen werden. Der adoptive Transfer AdV-spezifischer T-Zellen vom HLA-teilpassenden Familienspender als „Third-Party-Spender“ stellt eine rasch verfügbare und wenig toxische Behandlungsoption für Patienten mit refraktärer AdV-Erkrankung dar.

Interpretation des GnRH (LHRH)-Tests bei der Abklärung der Pubertas praecox

ZusammenfassungHintergrund: Traditionell wird für die Diagnose der zentralen Pubertas praecox ein GnRH (Gonadotropin-Releasing Hormon, Synonym: LHRH)-stimulierter LH/FSH-Quotient von >1 angegeben. Durch modernere sensitivere Assays werden heute jedoch niedrigere Gonadotropinwerte als früher bestimmt.Material und Methoden: selektive Literaturrecherche von 1989-2009 mittels Pubmed Ergebnisse: Es gibt bei der Verwendung moderner ultrasensitiver Gonadotropinassays der 3. Generation keine ausreichende Evidenz dafür, dass der GnRH-stimulierte LH/FSH-Quotient bei der Abklärung der Pubertas praecox der alleinigen LH-Messung überlegen ist. Durch niedrigere LH-Messungen im Vergleich zu Assays der 2. Generation scheint der LH/ FSH-Quotient auch bei Pubertätsbeginn zu niedrigeren Werten verschoben zu sein, sodass ein Quotient größer oder kleiner als 1 zur differenzialdiagnostischen Abklärung nicht mehr weiter empfohlen werden kann.Schlussfolgerung: Bei Verwendung moderner Gonadotropinassays der 3. Generation sollte zur Diagnose der Pubertas praecox der LH-Anstieg nach Stimulation betrachtet werden. Eine alleinige Beurteilung eines stimulierten LH/FSH-Quotienten birgt das Risiko einer falschen Diagnose bedingt durch die geringere Sensitivität.