Clinical Next-Generation Sequencing Pipeline Outperforms a Combined Approach Using Sanger Sequencing and Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification in Targeted Gene Panel Analysis

Εισαγωγή: Μεγάλος αριθμός ενδοκρινολογικών νοσημάτων έχει γενετική αιτιολογία. Η εφαρμογή των μέχρι σήμερα ευρέως χρησιμοποιούμενων συμβατικών τεχνικών της Μοριακής Βιολογίας (π.χ. αλληλούχηση κατά Sanger) αδυνατεί να αποσαφηνίσει σε πολλές περιπτώσεις την γενετική διαταραχή. Την αδυναμία αυτή καλύπτει η αλληλούχηση επόμενης γενιάς (Next Generation Sequencing, NGS), η οποία επιτρέπει την παράλληλη και μαζική αλληλούχηση πολλών γονιδίων σε πολλούς ασθενείς ταυτόχρονα σε μια μόνο δοκιμασία. Χαρακτηριστικά παραδείγματα ενδοκρινολογικών νοσημάτων, των οποίων η αναγνώριση της μοριακής διαταραχής δεν είναι πάντα εφικτή με τις συμβατικές μεθόδους, αποτελούν ο Μονογονιδιακός Σακχαρώδης Διαβήτης (ΜΣΔ) MODY, ο Συγγενής Υπερινσουλινισμός (ΣΥ), η Πολλαπλή Υποφυσιακή Ανεπάρκεια (ΠΥΑ) και οι Διαταραχές Διαφοροποίησης του Φύλου (ΔΔΦ). Ασθενείς με ΜΣΔ MODY και ΣΥ παρουσιάζουν διαταραχές στην έκκριση της ινσουλίνης από τα β-κύτταρα των νησιδίων Langerhans του παγκρέατος. Συγκεκριμένα, ασθενείς με ΜΣΔ MODY παρουσιάζουν μειωμένη έκκριση ινσουλίνης και κατά συνέπεια υπεργλυκαιμία, ενώ ασθενείς με ΣΥ παρουσιάζουν αυξημένη έκκριση ινσουλίνης, δυσανάλογη προς τα κυκλοφορούντα επίπεδα γλυκόζης στο αίμα, και κατά συνέπεια υπογλυκαιμία. Ασθενείς με ΠΥΑ μπορεί να παρουσιάζουν ανατομικές ανωμαλίες της υπόφυσης και δυσμορφίες του προσώπου, καθώς και ανεπάρκεια τουλάχιστον δύο ορμονών της υπόφυσης, ενώ ασθενείς με ΔΔΦ παρουσιάζουν διαταραχές στον εμβρυολογικό καθορισμό και στην διαφοροποίηση του χρωμοσωμικού, γοναδικού και ανατομικού φύλου, με αποτέλεσμα την γέννηση νεογνών με αμφίβολα ή ασαφή έξω γεννητικά όργανα. Η μοριακή ταυτοποίηση της διαταραχής είναι θεμελιώδους σημασίας, όχι μόνο για την αναγνώριση των παθολογικών παραλλαγών των γονιδίων, τα οποία ευθύνονται για τα παραπάνω νοσήματα, αλλά και για τον συσχετισμό φαινότυπου-γονότυπου, για τη θεραπεία, την πρόγνωση και την αναγνώριση συνοδών χαρακτηριστικών της νόσου καθώς και για την παροχή γενετικής συμβουλευτικής στον ασθενή και στην οικογένεια του. Επιπλέον, προϋπόθεση για την ορθολογική αντιμετώπιση του νεογνού με ΔΔΦ αποτελεί η ταυτοποίηση της μοριακής βλάβης, η οποία μπορεί να καθορίσει την απόφαση για το φύλο του παιδιού, απόφαση με σημαντικές συνέπειες στην ψυχοκοινωνική προσαρμογή και τη μελλοντική ποιότητα της ζωής του. Σκοπός: Ο σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν η αποσαφήνιση της μοριακής διαταραχής, ασθενών με γενετικά ενδοκρινολογικά νοσήματα, στους οποίους οι μέχρι σήμερα χρησιμοποιούμενες τεχνικές μοριακής ανάλυσης απέτυχαν να εντοπίσουν την μοριακή βλάβη, με την εφαρμογή μεθοδολογιών αλληλούχησης επόμενης γενιάς (Next Generation Sequencing Targeted Gene Panel, NGS TGP και Whole Exome Sequencing, WES). Συγκεκριμένα, διερευνήθηκε η γενετική αιτία 50 ασθενών με MODY, 17 ασθενών με ΣΥ, 2 ασθενών με ΠΥΑ και 2 ασθενών με ΔΔΦ. Ασθενείς και Μέθοδοι: Πενήντα ασθενείς με MODY ελέγχθηκαν για την παρουσία παθολογικών παραλλαγών σε μια ομάδα 7 γονιδίων (GCK, HNF1A, HNF4A, HNF1B, INS, ABCC8 και KCNJ11), τα οποία είναι γνωστό ότι συνδέονται με τον ΜΣΔ MODY. Δεκαεπτά ασθενείς με ΣΥ ελέγχθηκαν για την παρουσία παθολογικών παραλλαγών στην παραπάνω ομάδα γονιδίων, πολλά από τα οποία έχουν συνδεθεί με το ΣΥ αλλά και σε ακόμα 5 γονίδια (GLUD1, HADH, INSR, SLC16A1, TRMT10A), τα οποία επίσης σχετίζονται με τον ΣΥ. Οι ασθενείς με MODY ή ΣΥ, στους οποίους δεν ανιχνεύθηκε παθολογική παραλλαγή με την μεθοδολογία του NGS, ελέγχθηκαν για απαλείψεις και διπλασιασμούς των γονιδίων GCK, HNF1A, HNF4A, HNF1B και ABCC8 με την μέθοδο του MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification). Επιπλέον, οι ασθενείς με ΣΥ στους οποίους δεν ανιχνεύθηκε παθολογική παραλλαγή με την μεθοδολογία του NGS, ελέγχθηκαν και για την παρουσία των παθολογικών ιντρονικών παραλλαγών c.1333-1013A>G του γονιδίου ABCC8 και c.636+471G>T του γονιδίου HADH με την αλληλούχηση κατά Sanger. Στα πλαίσια της παρούσας εργασίας, ακόμη, διερευνήθηκε η συχνότητα της παραλλαγής p.S385C του γονιδίου KCNJ11 στον Ελληνικό πληθυσμό. Με τη μέθοδο WES ελέγχθηκαν 2 ασθενείς με ΠΥΑ και 2 ασθενείς με ΔΔΦ, με σκοπό την ανίχνευση παθολογικών παραλλαγών που ευθύνονται για το φαινότυπό τους. Όλες οι παθολογικές παραλλαγές που ανιχνεύθηκαν με την μεθοδολογία του NGS, επιβεβαιώθηκαν με την αλληλούχηση κατά Sanger. Αποτελέσματα: Στο 28% (14/50) των ασθενών με MODY ανιχνεύθηκαν παθολογικές παραλλαγές των γονιδίων ABCC8 (8%, 4/50), GCK (8%, 4/50), HNF1A (6%, 3/50), HNF1B (4%, 2/50) και HNF4A (2%, 1/50). Στο 6% (3/50) βρέθηκαν αβέβαιης σημασίας παραλλαγές του γονιδίου ABCC8. Καμία παθολογική παραλλαγή δεν ανιχνεύθηκε στα γονίδια KCNJ11 και INS. Πέντε νέες παθολογικές παραλλαγές ανιχνεύθηκαν: η p.C371X του γονιδίου GCK, η p.N402Y του γονιδίου HNF1A, η p.E285K του γονιδίου HNF4A, η p.M1514T και η p.S1386F του γονιδίου ABCC8. Ακόμη, 2 ασθενείς με MODY έφεραν εκ νέου απάλειψη ολόκληρου του γονιδίου HNF1Β. Στο 23.5% (4/17) των ασθενών με ΣΥ ανιχνεύθηκαν παθολογικές παραλλαγές των γονιδίων ABCC8 (11.8%, 2/17), GCK (5.9%, 1/17) και HNF4A (5.9%, 1/17), ενώ στο 11.8% (2/17) των ασθενών με ΣΥ βρέθηκαν αβέβαιης σημασίας παραλλαγές των γονιδίων KCNJ11, INSR και HNF4A. Τρεις νέες παθολογικές παραλλαγές ανιχνεύθηκαν: η p.V71A του γονιδίου GCK, η p.R333P του γονιδίου HNF4A και η p.I445Sfs*5 του γονιδίου ABCC8. Η συχνότητα της παραλλαγής p.S385C του γονιδίου KCNJ11 στον Ελληνικό πληθυσμό βρέθηκε να είναι 1.35% (>1%), δηλαδή πολυμορφισμός. Με την εφαρμογή του WES στους 2 ασθενείς με ΠΥΑ ανιχνεύθηκαν παθολογικές παραλλαγές των γονιδίων HS6ST1, IL17RD, SOX9 (νέα παραλλαγή) και ΒΜΡ4, GNRH1, SRA1 αντίστοιχα, οι οποίες πιθανώς ευθύνονται για κάποια από τα κλινικά χαρακτηριστικά που παρουσιάζουν, ενώ στους 2 ασθενείς με ΔΔΦ ανιχνεύθηκαν παθολογικές παραλλαγές των γονιδίων TACR3, WNT7A και SAMD9 (εκ νέου παραλλαγή), PMM2, ACTN4 αντίστοιχα, οι οποίες πιθανώς ευθύνονται για τα κλινικά χαρακτηριστικά που παρουσιάζουν. Συμπεράσματα: Η εφαρμογή της μεθοδολογίας του NGS προσέφερε γενετική διάγνωση στο 28% των ασθενών με MODY και στο 23.5% των ασθενών με ΣΥ, επέτρεψε την ταυτοποίηση 5 νέων παθολογικών παραλλαγών σε ασθενείς με MODY και 3 σε ασθενείς με ΣΥ και αποκάλυψε ότι οι παθολογικές παραλλαγές του γονιδίου ABCC8 στους ασθενείς με MODY ήταν ισάριθμες με τις παθολογικές παραλλαγές του γονιδίου GCK των ασθενών με MODY. Επιπλέον, με την εφαρμογή του WES στους προηγουμένως αδιάγνωστους ασθενείς με ΠΥΑ και στους ασθενείς με ΔΔΦ ανιχνεύθηκαν αρκετές παραλλαγές, οι οποίες ευθύνονται για τα κλινικά χαρακτηριστικά τους. Συμπεραίνεται ότι η εφαρμογή της μεθοδολογίας του NGS προσφέρει γρήγορα αποτελέσματα, αυξάνει την διαγνωστική ακρίβεια και είναι πιο οικονομική σε σύγκριση με την αλληλούχηση κατά Sanger. Συνεπώς, η μεθοδολογία του NGS αποτελεί ένα χρήσιμο εργαλείο για τη διάγνωση γενετικών ενδοκρινολογικών νοσημάτων.

Download Full-text

SAT0531 NEXT GENERATION SEQUENCING AND AUTOINFLAMMATORY SYNDROMES: CLINICAL AND GENETICAL CORRELATION ON AN ADULT POPULATION FROM A REFERRAL THIRD-CARE CENTRE

Annals of the Rheumatic Diseases ◽

10.1136/annrheumdis-2020-eular.5067 ◽

2020 ◽

Vol 79 (Suppl 1) ◽

pp. 1223-1223

Author(s):

J. R. Marques Soares ◽

M. Antolin Mate ◽

E. Garcia Arumi ◽

E. Tizzano Ferrari ◽

S. Bujan Rivas

Keyword(s):

Next Generation Sequencing ◽

Genetic Data ◽

Clinical Suspicion ◽

Gene Panel ◽

Adult Patients ◽

Next Generation ◽

Related Gene ◽

Unknown Significance ◽

Level Hospital ◽

Generation Sequencing

Background:Systemic autoinflammatory diseases (sAID) are a group of conditions with recurrent episodes of inflammation in absence of infection or autoimmune response. Its physiopathology mainly lies on mono/poligenic mutations involving genes related to the innate immune system response. Next Generation Sequencing (NGS) platformss have been a big step forward on sAID diagnosis, although a clinical and genetic correlation is still needed.Objectives:To review the sAID related gene panel variants identified using NGS sAID gene panel on a cohort of adult patients screened for sAID from a referral third-level hospital.To correlate genetic and clinical findings for sAID related variants identified in order to the clinical suspicion diagnosis of sAID.Methods:A retrospective review of a cohort of adult (≥ 16 yo) patients with available NGS sAID related gene panel (MiSeq Illumina sequencing platform including intron and exon variants from up to 17 sAID genes, with coverage depth > x100) among 2014 and 2019 was performed.Demographic, clinical and genetic data were collected in a database.Genetic variants were classified according to the American College of Medical Genetics/Association for Molecular Pathology classification as benign/likely benign/variable of unknown significance (VUS)/likely pathogenic/pathogenic. In case of polymorphisms or lack of genetic data, the variants were named as unclassified.A description of the cohort and an analysis of the correlation assessment between clinical data and genetic findings were performed.Results:246 out of 299 (82%) patients with NGS sAID gene panel had clinical data available. 170/246 (69%) were adult patients. The medium age was 48 yo, and the M/F ratio was 2.46. 87/170 (51%) adult patients presented 122 variants involving sAID genes (60/87 patients with a single variant). All the variants out of 7 seven were heterozygous variants.Variants were classified according to ACMG/AMP as follow: pathogenic/probably pathogenic: 22/122 (18%), unknown significance: 74/122 (60.6%), benign/probably benign: 6/122 (4.91%). 20/122 (16.4%) were unclassified variants or polymorphisms.The most frequent variants identified involved MEFV (54/122), NOD2/CARD15 (18/122) and TNFRSF1A (17/122 including 12 p.Arg121Gln variants) genes.37/122 (30%) variants correlated with the clinical picture in 33 patients, allowing to confirm the suspected diagnosis. Among the 122 variants, 7 not previously communicated variants were identified.No somatic variants were found.Conclusion:NGS sAID related gene panel is a useful tool for sAID diagnosis. In this cohort of 170 adult patients from a referral third-level hospital, genetic tests identified sAID related variants in almost half of them.20% of patients who underwent genetic NGS sAID related gene panel studies were finally diagnosed with sAID.The identification of a genetic variant (even pathogenic / likely pathogenic variant) is not diagnostic for sAID if there is not a suggestive clinical picture.Despite genetic findings, a careful evaluation of clinical – genetic correlation is needed to confirm the suspicion diagnosis, especially for low penetrance variants like TNFRSF1A p. Arg121Gln.References:Diagnostic utility of a targeted next-generation sequencing gene panel in the clinical suspicion of systemic autoinflammatory diseases: a multi-center study. Karacan I, Balamir A, Uğurlu S, et al. . Rheumatol Int. 2019 May;39(5):911-919. doi: 10.1007/s00296-019-04252-5. Epub 2019 Feb 19.Disclosure of Interests:None declared

Download Full-text

Next generation sequencing-based gene panel tests for the management of solid tumors

Cancer Science ◽

10.1111/cas.13837 ◽

2018 ◽

Vol 110 (1) ◽

pp. 6-15 ◽

Cited By ~ 20

Author(s):

Masayuki Nagahashi ◽

Yoshifumi Shimada ◽

Hiroshi Ichikawa ◽

Hitoshi Kameyama ◽

Kazuaki Takabe ◽

...

Keyword(s):

Next Generation Sequencing ◽

Solid Tumors ◽

Gene Panel ◽

Next Generation ◽

Generation Sequencing

Download Full-text

Next-Generation Sequencing Approach to Non–Small Cell Lung Carcinoma Yields More Actionable Alterations

Archives of Pathology & Laboratory Medicine ◽

10.5858/arpa.2017-0046-oa ◽

2017 ◽

Vol 142 (3) ◽

pp. 353-357 ◽

Cited By ~ 12

Author(s):

Mitra Mehrad ◽

Somak Roy ◽

Humberto Trejo Bittar ◽

Sanja Dacic

Keyword(s):

Next Generation Sequencing ◽

Lung Adenocarcinoma ◽

Small Cell ◽

Gene Panel ◽

Next Generation ◽

Small Cell Lung ◽

Genomic Alterations ◽

Generation Sequencing ◽

Gene Alterations ◽

Cancer Panel

Context.— Different testing algorithms and platforms for EGFR mutations and ALK rearrangements in advanced-stage lung adenocarcinoma exist. The multistep approach with single-gene assays has been challenged by more efficient next-generation sequencing (NGS) of a large number of gene alterations. The main criticism of the NGS approach is the detection of genomic alterations of uncertain significance. Objective.— To determine the best testing algorithm for patients with lung cancer in our clinical practice. Design.— Two testing approaches for metastatic lung adenocarcinoma were offered between 2012–2015. One approach was reflex testing for an 8-gene panel composed of DNA Sanger sequencing for EGFR, KRAS, PIK3CA, and BRAF and fluorescence in situ hybridization for ALK, ROS1, MET, and RET. At the oncologist's request, a subset of tumors tested by the 8-gene panel was subjected to a 50-gene Ion AmpliSeq Cancer Panel. Results.— Of 1200 non–small cell lung carcinomas (NSCLCs), 57 including 46 adenocarcinomas and NSCLCs, not otherwise specified; 7 squamous cell carcinomas (SCCs); and 4 large cell neuroendocrine carcinomas (LCNECs) were subjected to Ion AmpliSeq Cancer Panel. Ion AmpliSeq Cancer Panel detected 9 potentially actionable variants in 29 adenocarcinomas that were wild type by the 8-gene panel testing (9 of 29, 31.0%) in the following genes: ERBB2 (3 of 29, 10.3%), STK11 (2 of 29, 6.8%), PTEN (2 of 29, 6.8%), FBXW7 (1 of 29, 3.4%), and BRAF G469A (1 of 29, 3.4%). Four SCCs and 2 LCNECs showed investigational genomic alterations. Conclusions.— The NGS approach would result in the identification of a significant number of actionable gene alterations, increasing the therapeutic options for patients with advanced NSCLCs.

Download Full-text

Targeted next generation sequencing with an extended gene panel does not impact variant detection in mitochondrial diseases

BMC Medical Genetics ◽

10.1186/s12881-018-0568-y ◽

2018 ◽

Vol 19 (1) ◽

Cited By ~ 10

Author(s):

Morgane Plutino ◽

Annabelle Chaussenot ◽

Cécile Rouzier ◽

Samira Ait-El-Mkadem ◽

Konstantina Fragaki ◽

...

Keyword(s):

Next Generation Sequencing ◽

Mitochondrial Diseases ◽

Gene Panel ◽

Next Generation ◽

Targeted Next Generation Sequencing ◽

Variant Detection ◽

Generation Sequencing

Download Full-text

Identification of Genetic Hereditary Predisposition to Hematologic Malignancies By Clinical Next-Generation Sequencing

Blood ◽

10.1182/blood.v126.23.3854.3854 ◽

2015 ◽

Vol 126 (23) ◽

pp. 3854-3854 ◽

Cited By ~ 2

Author(s):

Amy E Knight Johnson ◽

Lucia Guidugli ◽

Kelly Arndt ◽

Gorka Alkorta-Aranburu ◽

Viswateja Nelakuditi ◽

...

Keyword(s):

Next Generation Sequencing ◽

Sanger Sequencing ◽

Family Members ◽

Hematologic Malignancies ◽

Dyskeratosis Congenita ◽

Molecular Diagnostic ◽

Next Generation ◽

Hereditary Predisposition ◽

Ngs Data ◽

Generation Sequencing

Abstract Introduction: Myelodysplastic syndrome (MDS) and acute leukemia (AL) are a clinically diverse and genetically heterogeneous group of hematologic malignancies. Familial forms of MDS/AL have been increasingly recognized in recent years, and can occur as a primary event or secondary to genetic syndromes, such as inherited bone marrow failure syndromes (IBMFS). It is critical to confirm a genetic diagnosis in patients with hereditary predisposition to hematologic malignancies in order to provide prognostic information and cancer risk assessment, and to aid in identification of at-risk or affected family members. In addition, a molecular diagnosis can help tailor medical management including informing the selection of family members for allogeneic stem cell transplantation donors. Until recently, clinical testing options for this diverse group of hematologic malignancy predisposition genes were limited to the evaluation of single genes by Sanger sequencing, which is a time consuming and expensive process. To improve the diagnosis of hereditary predisposition to hematologic malignancies, our CLIA-licensed laboratory has recently developed Next-Generation Sequencing (NGS) panel-based testing for these genes. Methods: Thirty six patients with personal and/or family history of aplastic anemia, MDS or AL were referred for clinical diagnostic testing. DNA from the referred patients was obtained from cultured skin fibroblasts or peripheral blood and was utilized for preparing libraries with the SureSelectXT Enrichment System. Libraries were sequenced on an Illumina MiSeq instrument and the NGS data was analyzed with a custom bioinformatic pipeline, targeting a panel of 76 genes associated with IBMFS and/or familial MDS/AL. Results: Pathogenic and highly likely pathogenic variants were identified in 7 out of 36 patients analyzed, providing a positive molecular diagnostic rate of 20%. Overall, 6 out of the 7 pathogenic changes identified were novel. In 2 unrelated patients with MDS, heterozygous pathogenic sequence changes were identified in the GATA2 gene. Heterozygous pathogenic changes in the following autosomal dominant genes were each identified in a single patient: RPS26 (Diamond-Blackfan anemia 10), RUNX1 (familial platelet disorder with propensity to myeloid malignancy), TERT (dyskeratosis congenita 4) and TINF2 (dyskeratosis congenita 3). In addition, one novel heterozygous sequence change (c.826+5_826+9del, p.?) in the Fanconi anemia associated gene FANCA was identified. . The RNA analysis demonstrated this variant causes skipping of exon 9 and results in a premature stop codon in exon 10. Further review of the NGS data provided evidence of an additional large heterozygous multi-exon deletion in FANCA in the same patient. This large deletion was confirmed using array-CGH (comparative genomic hybridization). Conclusions: This study demonstrates the effectiveness of using NGS technology to identify patients with a hereditary predisposition to hematologic malignancies. As many of the genes associated with hereditary predisposition to hematologic malignancies have similar or overlapping clinical presentations, analysis of a diverse panel of genes is an efficient and cost-effective approach to molecular diagnostics for these disorders. Unlike Sanger sequencing, NGS technology also has the potential to identify large exonic deletions and duplications. In addition, RNA splicing assay has proven to be helpful in clarifying the pathogenicity of variants suspected to affect splicing. This approach will also allow for identification of a molecular defect in patients who may have atypical presentation of disease. Disclosures No relevant conflicts of interest to declare.

Download Full-text

Assay of frequency and spectrum of genetic variants in TTN in healthy russian population

Translational Medicine ◽

10.18705/2311-4495-2021-8-5-29-37 ◽

2021 ◽

Vol 8 (5) ◽

pp. 29-37

Author(s):

Yu. A. Vakhrushev ◽

A. A. Kozyreva ◽

S. V. Zhuk ◽

O. P. Rotar ◽

A. A. Kostareva

Keyword(s):

Next Generation Sequencing ◽

Genetic Variants ◽

Sanger Sequencing ◽

Heart Diseases ◽

Genetic Research ◽

Russian Population ◽

Next Generation ◽

Data Bases ◽

International Data ◽

Generation Sequencing

Background. Gene TTN associated with all types of cardiomyopathy, however its large size (294 b.p.) warrants a lot of individual unique genetic variants or variants with low frequency, that aggravates their interpretation. Besides that nowadays there is no data about spectrum of variants in this gene in healthy Russian population. Recognition frequency and spectrum of variants in gene TTN in healthy Russian population will allow us to use it for interpretation results of molecular genetic research for patients with different heart pathology, and define prognosis for different heart diseases.Objective. Recognize frequency and spectrum of single nucleotide and truncating variants in gene TTN in healthy Russian population and compare it with international data bases, and evaluate level of pathogenicity these variants and their distributing across titin structure.Design and methods. 192 men in age 55,8±6,6 years were tested with next-generation sequencing. Identified genetic variants were confirmed by Sanger sequencing. Results. Allele missense variant frequency (with frequency less than 0.1%) in TTN in healthy Russian population amount to 15.1 %, and truncating variants — 0.52 %. 37,9 % of them were variants of unknown significance, 62 % — likely-benign and 0.1 % — benign. There was no pathological and likely-pathological variants. Identified genetic variants distributed throughout the titin structure.Conclusion. Received result is congruent с international data bases and researches. Expended laboratory method (Next generation sequencing and confirmation with Sanger sequencing) can be used both in clinical practice, and in creating data bases of genetic variants in healthy Russian population.

Download Full-text