Jackson Alves da Silva Queiroz
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Luciane Soares Alves
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Deusilene Souza Vieira Dall’acqua
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Luan Felipo Botelho Souza
Introdução: O desenvolvimento de primers é extremamente importante para pesquisas moleculares. Objetivos: O presente estudo objetivou desenhar e validar primers in silico para detecção do vírus sincicial respiratório humano (RSVH). Materiais e Métodos: Foi construído um banco de 100 sequências de genoma completo do Vírus Sincicial Respiratório Humano (RSVH) depositadas no Genbank (NCBI). Realizado um alinhamento múltiplo global utilizando o algoritimo Clustal W, mapeadas as regiões conservadas e selecionado os primers. Posteriormente submetidos a análise dos parâmetros especificidade, pela ferramenta BLAST, concentração de GC%, TMelting, comprimento, formação de dímeros e hairpin utilizando o software Oligo Analyser, validando-os para uso in vitro. Para discussão dos resultados, foram selecionados 14 primers de estudos realizados, submetidos à metodologia proposta neste estudo, comparando os dados obtidos. A região alvo escolhida foi o gene da Glicoproteína G, pela presença de sítios conservados. Resultados: Os primers amplificam um fragmento de 381pb, que submetido a uma segunda PCR, resulta em 109 pb correspondente ao tipo A do vírus e 168 pb para o tipo B, permitindo a detecção viral e a distinção de genótipos. Os primers possuem tamanho de 21 a 24 pb, com uma temperatura de melting entre 48,9 oC e 55,3 oC. A concentração de GC% varia de 33,3% a 52,4%. O número de bases complementares na análise de dímeros e hairpin manteve-se abaixo de 5 bases. A Energia Livre de Gibbs (Delta G) acima de -9 kcal.moles(-1) como desejado. Conclusão: Os valores obtidos na validação dos primers estão em concordância com os já utilizados em estudos de referência, validando assim o seu uso in vitro.
Introduction: Developing primers is extremely important to molecular researches. Objectives: This study aims to drawing and validate in silico primers for detection of Human Respiratory Syncytial Virus (RSVH). Materials and Methods: It was built a database of 100 complete genome sequences of Human Respiratory Syncytial Virus (RSVH) deposited in the Genbank (NCBI), carried out a global multiple alignment using the algoritm Clustal W, thus mapping the conserved regions, and selecting primers, subsequently submitted to analysis of parameters such as specificity, by the BLAST tool, concentration of GC% TMelting, length, and formation of dimers and hairpins using the software Oligo Analyser, validating them to use in vitro. For discussion of the results, we selected 14 primers of studies already carried out and submitted the methodology proposed in this study, comparing the data obtained. The selected target region was the gene encoding the Glycoprotein G, by the presence of conserved sites. Results: The primers selected amplifies a fragment of 381 bp in the 1st PCR, which subjected to a second PCR results in 109 bp corresponding to the type A of the virus and 168 base pairs for the type Bwhat allows not only viral detection, as the distinction of the type to which it belongs. The primers have size from 21 to 24 base pairs, having a melting temperature (Tmelting) between 48,9o C and 55,3o C and GC% concentration ranging from 33.3% to 52.4%. The number of complementary bases in the dimers and hairpins analysis was maintained below 5 bases, while the Gibbs free energy (Delta G) was kept above kcal.mole -9(-1) as desired. Conclusion: All values obtained in the validation of the primers are in agreement with the ones already used in the reference studies, thereby validating its use in vitro.
Development of a multiplex RT-PCR for simultaneous diagnosis of human metapneumovirus (HMPV) and human respiratory syncytial virus (HRSV) from clinical specimens
