Στο αιμοποιητικό σύστημα των θηλαστικών, απαντώνται πάνω από 10 διακριτοί διαφοροποιημένοι τύποι κυττάρων και όλοι προέρχονται από έναν προγονικό αιμοποιητικό κυτταρικό τύπο, το αρχέγονο αιμοποιητικό στελεχιαίο κύτταρο (Hematopoietic Stem Cell, HSC). Τα HSCs, πέραν από τη δυνατότητά τους να διαφοροποιούνται προς όλες τις αιμοποιητικές σειρές (πολυγραμμική διαφοροποίηση), είναι αυτά τα οποία συντηρούν ολόκληρο το αιμοποιητικό σύστημα εφ’ όρου ζωής χάρη στην ικανότητά τους να διατηρούν σταθερό τον πληθυσμό τους μέσω της αυτό-ανανέωσης (self-renewal). Αυτά τα δύο λοιπόν χαρακτηριστικά, η αυτό-ανανέωση και η πολυγραμμική διαφοροποίηση είναι αυτά που καθιστούν τα HSCs ένα ισχυρό κλινικό εργαλείο, καθώς και το κατάλληλο μοντέλο για τη βιολογία των στελεχιαίων κυττάρων. Σκοπός της παρούσας εργασίας είναι η διερεύνηση των επιγενετικών, κατά βάση, μηχανισμών που συμμετέχουν στις δύο αυτές λειτουργίες των HSCs του ανθρώπου. Αρχικά, διερευνήθηκαν μέθοδοι ex vivo έκπτυξης των HSCs με την επίδραση μικρών χημικών μορίων (small molecules) και επιδιώχθηκε η ανάπτυξη πρωτοκόλλου που επιτρέπει την βέλτιστη έκπτυξη τους. Μελετήθηακν οι επιδράσεις των μορίων αυτών τόσο στο φαινότυπο των HSCs όσο και στην ικανότητα ενοίκησης ανοσοκατεσταλμένου μυελού των οστών, και διαφοροποίησης με πειράματα ξενο-μεταμόσχευσης σε σχετικό ζωικό μοντέλο. Εν συνεχεία, μελετήθηκαν οι διαφορές στο μεταγραφικό επίπεδο με αλληλούχηση μεταγραφώματος RNAseq και βιοπληροφορική ανάλυση ενώ τέλος ταυτοποιήθηκε ένας συνδυασμός μορίων για την βέλτιστη έκπτυξη των HSCs. Στο δεύτερο σκέλος της εργασίας, διερευνήθηκε η δυναμική του επιγενετικού τοπίου που συμμετέχει στην διαφοροποίηση των HSCs του ανθρώπου προς την ερυθρά σειρά. Αναλύθηκε η προσβασιμότητα χρωματίνης με DNase I-seq και οι μεταγραφικές διαφορές με RNAseq κατά την ex vivo επαγωγή της ερυθροποίησης και δημιουργήθηκαν γενετικοί χάρτες με όλα τα ρυθμιστικά στοιχεία (DNase I Hypersensitive Sites, DHS) και τα γονίδια τα οποία συμμετέχουν κατά την ερυθροποίησης. Εν συνεχεία, με τη χρήση μαθηματικών μοντέλων μελετήθηκαν οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ DHS και γονιδίων και πως αυτές μεταβάλλονται κατά τη διαφοροποίηση και ταυτοποιήθηκαν επιγενετικές λειτουργικές δομές που συμμετέχουν στους μηχανισμούς διαφοροποίησης και δέσμευσης στην εκάστοτε κυτταρική σειρά. Πειράματα πολυγραμμικής διαφοροποίησης και κλωνογενούς ικανότητας των κυττάρων κατά την ερυθροποίηση καταδεικνύουν την ύπαρξη διακριτών λειτουργικών σταδίων κατά την διαφοροποίηση, ενδεικτικών των επιγενετικών λειτουργικών δομών που ταυτοποιήθηκαν νωρίτερα. Τέλος, διερευνήθηκαν οι μεταβολές των πληθυσμών των προγονικών κυττάρων στο μεταγραφικό επίπεδο κατά τον διαχωρισμό της ερυθροειδικής και μεγακαρυοκυτταρικής σειράς με ανάλυση του μεταγραφώματος σε μονήρη κύτταρα (single-cell RNAseq) με βιοπληροφορική ανάλυση. Στο τρίτο και τελευταίο σκέλος, έγινε προσπάθεια απομόνωσης των αιμοποιητικών προγονικών κυττάρων με διαφορικό δυναμικό διαφοροποίησης προς τις διάφορες αιμοποιητικές σειρές. Με τη χρήση μεθόδων απομόνωσης μονήρων κυττάρων με κυτταρομετρία ροής και πειραμάτων κλωνογενούς ικανότητας και πολυγραμμικής διαφοροποίησης ταυτοποιήθηκαν προγονικά κύτταρα με συγκεκριμένο διαφοροποιητικό δυναμικό και διακριτό ανοσοφαινότυπο. Τέλος, προτείνεται μια σειρά από δείκτες επιφανείας ικανοί να τα διαχωρίσουν τους διάφορους προγονικούς τύπους βάσει του διαφοροποιητικού τους δυναμικού, ενώ ταυτοποιούνται νέοι δείκτες που ικανοί να διαχωρίσουν τους προγόνους της ερυθράς σειράς.
Single-cell approaches identify the molecular network driving malignant hematopoietic stem cell self-renewal
