Antibacterial activity of Cordyline fruticosa leaf extracts and its endophytic fungi extracts

Elfita, Mardiyanto, Fitrya, Larasati JE, Julinar, Widjajanti H, Muharni. 2019. Antibacterial activity of Cordyline fruticosa leaf extracts and its endophytic fungi extracts. Biodiversitas 20: 3804-3812. Endophytic fungi live by forming colonies in plant tissues without harming the host plant. Cordyline fruticose has been used as traditional medicine for the treatment of pathogenic bacterial infections; therefore, its endophytic fungi are expected to have similar activity. In this study, C. fruticosa leaves were extracted with gradient solvents and evaluated for their antibacterial activity using the Kirby–Bauer method against Gram-negative (Salmonella typhi, Escherichia coli) and Gram-positive (Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis) bacteria. The extracts of endophytic fungi from C. fruticosa leaves were evaluated for their antibacterial activity, as well. The endophytic fungus with good antibacterial activity was identified by molecular and phylogenetic methods. Chemical compounds from endophytic fungus DB1 were isolated by chromatography and subsequently determined by spectroscopy. The methanol extract of C. fruticosa leaves showed strong antibacterial activity equivalent to the endophytic fungus (DB1). Molecular identification and analysis through the phylogenetic tree showed that the DB1 fungus has a high level of similarity to Neurospora tetrasperma strain APBSDSF108. The antibacterial compounds (compound 1 and 2) isolated from the endophytic fungus DB1 were identified as 4-hydroxy-5-phenylpenta-1,3-dien-1-yl acetate and ergosterol, respectively.

A-to-I RNA editing is developmentally regulated and generally adaptive for sexual reproduction in Neurospora crassa

Although fungi lack adenosine deaminase acting on RNA (ADAR) enzymes, adenosine to inosine (A-to-I) RNA editing was reported recently in Fusarium graminearum during sexual reproduction. In this study, we profiled the A-to-I editing landscape and characterized its functional and adaptive properties in the model filamentous fungus Neurospora crassa. A total of 40,677 A-to-I editing sites were identified, and approximately half of them displayed stage-specific editing or editing levels at different sexual stages. RNA-sequencing analysis with the Δstc-1 and Δsad-1 mutants confirmed A-to-I editing occurred before ascus development but became more prevalent during ascosporogenesis. Besides fungal-specific sequence and secondary structure preference, 63.5% of A-to-I editing sites were in the coding regions and 81.3% of them resulted in nonsynonymous recoding, resulting in a significant increase in the proteome complexity. Many genes involved in RNA silencing, DNA methylation, and histone modifications had extensive recoding, including sad-1, sms-3, qde-1, and dim-2. Fifty pseudogenes harbor premature stop codons that require A-to-I editing to encode full-length proteins. Unlike in humans, nonsynonymous editing events in N. crassa are generally beneficial and favored by positive selection. Almost half of the nonsynonymous editing sites in N. crassa are conserved and edited in Neurospora tetrasperma. Furthermore, hundreds of them are conserved in F. graminearum and had higher editing levels. Two unknown genes with editing sites conserved between Neurospora and Fusarium were experimentally shown to be important for ascosporogenesis. This study comprehensively analyzed A-to-I editing in N. crassa and showed that RNA editing is stage-specific and generally adaptive, and may be functionally related to repeat induced point mutation and meiotic silencing by unpaired DNA.

Nuclear interactions in a heterokaryon: insight from the model Neurospora tetrasperma

A heterokaryon is a tissue type composed of cells containing genetically different nuclei. Although heterokaryosis is commonly found in nature, an understanding of the evolutionary implications of this phenomenon is largely lacking. Here, we use the filamentous ascomycete Neurospora tetrasperma to study the interplay between nuclei in heterokaryons across vegetative and sexual developmental stages. This fungus harbours nuclei of two opposite mating types ( mat A and mat a ) in the same cell and is thereby self-fertile. We used pyrosequencing of mat -linked SNPs of three heterokaryons to demonstrate that the nuclear ratio is consistently biased for mat A -nuclei during mycelial growth (mean mat A / mat a ratio 87%), but evens out during sexual development (ratio ranging from 40 to 57%) . Furthermore, we investigated the association between nuclear ratio and expression of alleles of mat -linked genes and found that expression is coregulated to obtain a tissue-specific bias in expression ratio: during mycelial extension, we found a strong bias in expression for mat A -linked genes, that was independent of nuclear ratio, whereas at the sexual stage we found an expression bias for genes of the mat a nuclei. Taken together, our data indicate that nuclei cooperate to optimize the fitness of the heterokaryon, via both altering their nuclear ratios and coregulation genes expressed in the different nuclei.

Queratinasas microbianas: microorganismos, producción y caracterización

Actualmente las proteasas alcalinas son ampliamente utilizadas en la industria del cuero, en distintas formulaciones de detergentes, también en el proceso de recuperación de plata, y en la producción de hidrolizados de proteínas. Comúnmente, todas estas proteasas se obtienen de fuentes microbianas que crecen en sustrato relativamente caros. Muchos estudios demuestran que cerca del 40% del costo de producción de estas enzimas está relacionada con la composición del medio de cultivo. Para reducir el costo de producción es importante la búsqueda de microorganismos capaces de crecer y de producir suficiente cantidad de la enzima usando sustratos baratos. En este sentido desechos de naturaleza queratínica tienen un enorme potencial para ser utilizacos como sustrato para la producción de un grupo de enzimas proteolíticas llamado queratinasas, las cuales presentan la capacidad de hidrolizar la queratina, proteína sumamente resistente a la degradación por su estructura y por la presencia en su molécula de puentes disulfuro. En el presente trabajo de tesis seis cepas de hongos no patógenos aislados de suelos alcalinos de la provincia de Buenos Aires, Argentina, (Acremonium murorum, Aspergillus sidowii, Cladosporium cladosporioides, Neurospora tetrasperma, Purpureocillium lilacinum (ex Paecilomyces lilacinus) y Westerdikella dispersa) fueron evaluados de acuerdo a su capacidad de producir enzimas queratinolíticas. Entre estas cepas, P. lilacinum resultó ser el hongo con mayor producción de actividad proteolítica y queratinolítica, tanto en fermentación en sustrato solido como en sumergido, siendo seleccionado para continuar con este trabajo. Se establecieron las condiciones óptimas de cultivo para la producción enzimática utilizando diseños experimentales y la metodología de superficie de respuesta. Las condiciones óptimas fueron: 7,10 g/l de glucosa; 0.0065 mg/l de CaCl<SUB>2</SUB> y pH inicial de 5.60; en estas condiciones de cultivo, el rendimiento máximo para la producción de queratinasas predijo por el modelo fue de 26,7 U azo/ml. La validación del modelo demostró que, tanto el polinomio como las correspondientes superficies de respuesta obtenidas describen adecuadamente la influencia de la concentración de glucosa, de calcio y el pH inicial en la producción de queratinasas. Luego de la optimización del medio de cultivo se procedió a la purificación de la enzima, las etapas involucradas en la purificación fueron la precipitación con sulfato de amonio y distintas técnicas cromatográficas de intercambio iónico y permeación en gel, con un factor de purificación de 19.8 veces y una actividad específica de 1430 U/mg de proteína. El peso molecular de la enzima, determinado por SDS-PAGE, fue de 37 kDa. La queratinasa extracelular de P. lilacinum se caracteriza por su apreciable estabilidad en un amplio intervalo de pH (4.0 a 9.0), y hasta 65°C. La inhibición que presenta frente a PMSF (98,2% de la inhibición) sugiere su naturaleza serínica. La enzima es activa y estable en presencia de solventes orgánicos tales como dimetilsulfóxido, metanol, e isopropanol; ciertos tensioactivos como Triton X-100, dodecilsulfato de sodio, y Tween 85, y agentes oxidante como el peróxido de hidrógeno. Sus parámetros cinéticos de inactivación térmica fueron estimados bajo diferentes condiciones y fue posible observar cómo afectan calcio, el glicerol y el propilenglicol a la estabilidad térmica de la enzima. Se investigó la inmovilización covalente de la queratinasa pura sobre un soporte de quitosán, optimizando la concentración de los agentes entrecruzantes glutaraldehído y genipina, así como también el tiempo de activación. La enzima inmovilizada presentó mayor estabilidad frente a pH y temperaturas extremas en comparación con la enzima libre, además retiene 61.37 % de la actividad enzimática inicial después de cinco ciclos de hidrolisis. Se estudiaron las potenciales aplicaciones biotecnológicas del extracto enzimático, entre ellas se estudió por su compatibilidad y estabilidad frente a detergentes comerciales (7 mg/ml) como Ariel y Skip, observándose que éste retiene más de 70 % de su actividad proteolítica inicial después de 1 h de incubación a 40ºC. La simulación de lavado reveló que el extracto era capaz de eliminar eficazmente las manchas de sangre. Se estudió también la posibilidad de utilizar este extracto enzimático en la recuperación de plata a partir de placas radiográficas usadas. En dosis de enzima de 6,9 U azoc/ml y a 60ºC, la eliminación completa de la capa de gelatina con la liberación completa de las partículas de plata se alcanzó en 6 min a pH 9.0. Por último, P. lilacinum además de producir enzimas queratinolíticas con la producción de paralela de amonio, mostró la capacidad producir sideróforos y ácido indolacético (IAA) al crecer con residuo pelo como sustrato en presencia de Trp y baja concentración de hierro. Se realizaron ensayos a nivel de invernadero con plantas de tomate, encontrándose que, en términos de peso seco, el hidrolizado mostró un efecto similar al del fertilizante de referencia. Además, el hidrolizado demostró poseer actividad antifúngica contra varios patógenos de las plantas. Estos resultados indican el potencial biotecnológico tanto del extracto enzimático como el de la enzima pura de P. lilacinum siendo interesante además la capacidad del hongo de producir esta enzima utilizando un como sustrato un residuo de valor nulo, con lo cual sería de esperar que su costo de producción resulte relativamente bajo.

Sex-linked transcriptional divergence in the hermaphrodite fungus Neurospora tetrasperma

In the filamentous ascomycete Neurospora tetrasperma , a large (approx. 7 Mbp) region of suppressed recombination surrounds the mating-type ( mat ) locus. While the remainder of the genome is largely homoallelic, this region of recombinational suppression, extending over 1500 genes, is associated with sequence divergence. Here, we used microarrays to examine how the molecular phenotype of gene expression level is linked to this divergent region, and thus to the mating type. Culturing N. tetrasperma on agar media that induce sexual/female or vegetative/male tissue, we found 196 genes significantly differentially expressed between mat A and mat a mating types. Our data show that the genes exhibiting mat -linked expression are enriched in the region genetically linked to mating type, and sequence and expression divergence are positively correlated. Our results indicate that the phenotype of mat A strains is optimized for traits promoting sexual/female development and the phenotype of mat a strains for vegetative/male development. This discovery of differentially expressed genes associated with mating type provides a link between genotypic and phenotypic divergence in this taxon and illustrates a fungal analogue to sexual dimorphism found among animals and plants.