Entwicklungsansätze für Impfstoffe gegen Hepatitis-C-Virus-Infektionen

ZusammenfassungMehr als 10 Jahre nach der Zulassung der ersten direkt wirkenden antiviralen Wirkstoffe zur Behandlung der Hepatitis C bleibt die Inzidenz der Hepatitis-C-Virus-(HCV-)Infektion ungebrochen hoch. In manchen Ländern stecken sich mehr Menschen neu mit dem Virus an, als Patienten durch eine erfolgreiche Therapie geheilt werden. Die Entwicklung eines prophylaktischen Impfstoffes könnte die Transmission des Virus unterbinden und dadurch einen wesentlichen Beitrag zur Kontrolle dieser weltweit verbreiteten Infektion leisten. In diesem Artikel werden die besonderen Herausforderungen und die aktuellen Ansätze der HCV-Impfstoffentwicklung dargestellt.HCV ist ein hochgradig diverses und wandlungsfähiges Virus, das zumeist dem Immunsystem entkommt und chronische Infektionen etabliert. Andererseits heilt die HCV-Infektion bei bis zu einem Drittel der exponierten Individuen aus, sodass eine schützende Immunität erreichbar ist. Zahlreiche Untersuchungen zu den Determinanten einer schützenden Immunität gegen HCV zeichnen ein immer kompletteres Bild davon, welche Ziele ein Impfstoff erreichen muss. Sehr wahrscheinlich werden sowohl starke neutralisierende Antikörper als auch wirkungsvolle zytotoxische T‑Zellen gebraucht, um sicher vor einer chronischen Infektion zu schützen. Die Schlüsselfrage ist, welche Ansätze besonders breit wirksame Antikörper und T‑Zellen heranreifen lassen. Dies wird erforderlich sein, um vor der großen Fülle unterschiedlicher HCV-Varianten zu schützen. Die jüngsten Erfolge von mRNA-Impfstoffen öffnen neue Türen auch für die HCV-Impfstoffforschung. Kombiniert mit einem tieferen Verständnis der Struktur und Funktion der viralen Hüllproteine, der Identifizierung kreuzprotektiver Antikörper- und T‑Zellepitope sowie der Nutzung standardisierter Verfahren zur Quantifizierung der Wirksamkeit von Impfkandidaten ergeben sich neue Perspektiven für die Entwicklung eines Impfstoffes.

„Heroismus als Weg zur Transzendenz“. Metadiskursive Religionsbezüge und apokalyptische Diskurspraxis der Neuen Rechten

ZusammenfassungIn der Rechtsextremismusforschung wird die Instrumentalisierung von Religionen zu Zwecken politischer Agitation ausführlich untersucht. Der Beitrag differenziert diese Perspektive, indem er nach der Form und Funktion religiöser Deutungsmuster in rechten Krisennarrativen fragt.In einem theoretischen Teil werden in einer wissenssoziologischen Perspektive zunächst strukturelle Gemeinsamkeiten von Konservatismus, Rechtspopulismus und der Neuen Rechten sowie Ähnlichkeiten von rechten Krisennarrativen und apokalyptischen Texten hervorgehoben. In zwei empirischen Analyseschritten werden dann (I) anhand von Quellen aus dem Umfeld der Neuen Rechten zwei metadiskursive Bezüge auf Religionskonzepte systematisiert und (II) durch die exemplarische Analyse populärer rechter Narrative die Struktur und Funktion von apokalyptischen Deutungsmustern skizziert.Esoterische Religionsbezüge rekurrieren auf die traditionalistische Philosophie und betonen den immanenten Gehalt einer philosophia perennis. Im Rahmen exoterischer Religionsbezüge werden vor allem die sozialintegrativen Aspekte der Religion als Institution hervorgehoben. In metapolitischen Krisennarrativen werden beide Bezüge in Form von apokalyptischen Deutungsmustern aufbereitet, wobei der Figur des Katechon eine wichtige Rolle zukommt. Dabei wird deutlich, dass die Neue Rechte apokalyptische Deutungsmuster tradiert, weil sie zur Legitimation und Durchsetzung ihrer politischen Hegemonieambitionen auf permanente Krisennarrationen angewiesen ist.Die wissenssoziologische Perspektive macht eine ambivalente Struktur neurechter Texte sichtbar und kann Anschluss- und Transformationsmöglichkeiten von rechten Narrativen und Diskursen erklären. Der Beitrag basiert auf einer diskursanalytischen Untersuchung neurechter Publikationen.

Anorektale Funktionsdiagnostik

Zusammenfassung. Die anorektale Funktionsdiagnostik ermöglicht die Messung des Analsphinkterdrucks, die Evaluierung der Rektumsensibilität sowie die Überprüfung der rektoanalen Reflexe, die wesentliche Elemente der Beurteilung der Darmentleerung darstellen. Sie wird mit einem Ballonexpulsionstest kombiniert, um sicherzustellen, dass die manometrischen Befunde mit der anorektalen Funktion übereinstimmen. Diese Tests finden in der diagnostischen Abklärung der chronischen Stuhlentleerungsstörung, der Obstipation und der fäkalen Inkontinenz ihre Anwendung, können aber auch im prä- und postoperativen Setting, bei funktionellen anorektalen Schmerzen und anderen Störungen der Beckenbodenfunktion Klärung bringen. Bei den meisten Patienten, die zur Untersuchung dieser Symptome überwiesen werden, ist eine umfassende Beurteilung der anorektalen Struktur und Funktion erforderlich. Aufgrund der hohen Variabilität der Normalwerte und Komplexität der anorektalen Funktion liefert keine einzelne Untersuchung alle Informationen, die für eine symptomerklärende, schlüssige Diagnose erforderlich sind und die Therapieentscheidung beeinflussen. Die anorektale Manometrie ist nützlich, um das Ausmass der Beeinträchtigung der anorektalen Funktion zu beurteilen und zwischen organischen und funktionellen Erkrankungen (inklusive Beckenbodendyssynergie) zu unterscheiden. Eine vorangehende ausführliche Anamnese sowie endoskopische (Prokto- / Rektoskopie) und bildgebende Verfahren (anorektale Endosonographie, dynamische MR-Defäkographie) vervollständigen die Diagnostik.

Chronische Pankreatitis

Zusammenfassung Klinisches/methodisches Problem Bei der chronischen Pankreatitis (CP) handelt es sich um eine langanhaltende Entzündung der Bauchspeicheldrüse, welche die normale Struktur und Funktion des Organs schädigt. Das breite Spektrum an entzündlichen Pankreaserkrankungen umfasst einzelne Entitäten, wie die fokale Pankreatitis (FP) oder den Pseudotumor („mass-forming pancreatitis“), welche radiomorphologisch ein Adenokarzinom der Bauchspeicheldrüse (PDAC) nachahmen können. In weiterer Folge kann eine Fehldiagnose zu einem vermeidbaren und unnötigen operativen Eingriff oder zu einer Therapieverzögerung führen. Radiologische Standardverfahren Der Ultraschall (US) ist das primäre bildgebende Verfahren zur Abklärung von Pankreaserkrankungen, gefolgt von kontrastmittelverstärkter Computertomographie (KM-CT), die als meistverwendete Methode bei der diagnostischen Abklärung von Bauchspeicheldrüsenerkrankungen gilt. Die Magnetresonanztomographie (MRT) und/oder die MR-Cholangiopankreatographie (MRCP) können als Problemlöser eingesetzt werden, um zwischen soliden und zystischen Läsionen zu unterscheiden sowie auch Anomalien der Pankreasgänge auszuschließen, welche bei rezidivierender akuter Pankreatitis (AP) vorhanden sein können, oder um frühe Anzeichen einer CP zu visualisieren. Die MRCP hat dabei die diagnostische endoskopische retrograde Cholangiopankreatographie (ERCP) in der Abklärung von therapeutischen Interventionen im Wesentlichen ersetzt. Empfehlung für die Praxis Folgender Übersichtsartikel fasst die relevanten Merkmale in der Computertomographie (CT) und MRT zusammen, um eine akkurate, frühzeitige Diagnose einer CP zu stellen und eine Differenzierung zwischen FP und Pankreaskarzinom zu ermöglichen, um somit – auch in schwierigen Fällen – ein adäquates Therapiemanagement zu gewährleisten.

Electron cryo-tomography during the resolution revolution: a multi-scale study from protein denaturation to plant plastid bioenergetics

Diese Arbeit ist ein detaillierter Bericht über die Forschungsaktivitäten, die ich während meiner Promotion am Max-Planck-Institut für Biophysik durchgeführt habe. Mit dem Aufkommen der direkten Elektronendetektoren erlebte die Transmissionselektronenmikroskopie von gefrorenen hydratisierten Proben (Kryo-EM) einen epochalen Wandel, die sogenannte “Auflösungsrevolution”. Ab den 2010er Jahren ermöglichte die Kommerzialisierung der ersten direkten Detektoren die Erforschung biologischer Phänomene in beispiellosem Detail und machte Kryo-EM zu einer der leistungsstärksten (und gefragtesten) Forschungsmethoden in den Biowissenschaften. Meine Forschung konzentrierte sich auf die Verwendung der Elektronen-Kryotomographie, um zwei herausfordernde Ziele zu erreichen. Das erste bestand darin, die Denaturierung von Proteinen an der Luft-Wasser-Grenzfläche zu untersuchen, und das zweite die molekulare Landschaft eines lichtempfindlichen Chloroplastenvorläufers, des Etioplasten, zu beschreiben. Um die Relevanz, Herausforderungen und Auswirkungen meiner Arbeit zu vermitteln, habe ich diese Arbeit in drei Kapitel unterteilt. Kapitel eins enthält eine Einführung in die Transmission-Elektronenmikroskopie. Nach einer kurzen Zusammenfassung der historischen Meilensteine in der Disziplin beschreibe ich die wesentlichen Komponenten des TEM und deren Funktionsweise. Hier lege ich besonderen Wert auf die Struktur elektromagnetischer Linsensysteme, wie sie den Weg der Elektronen beim Durchlaufen der Säule beeinflussen und wie Bilder entstehen. Der hardwarebezogene Teil der Einführung wird durch eine vereinfachte Beschreibung der Elektronendetektoren abgeschlossen, in der ich die revolutionären Aspekte der direkten Elektronendetektoren, mit der Struktur und Funktion von CCD-Detektoren (Charge Coupled Device detector) vergleiche. Als nächstes konzentriere ich mich auf die theoretischen Prinzipien der Bilderzeugung. Um die Hauptphänomene im Zusammenhang mit der Bildqualität in TEM hervorzuheben, stelle ich grundlegende Konzepte wie den Einfluss von Elektronenenergie und optischen Aberrationen vor, gefolgt von einer ausführlicheren Beschreibung des Ursprungs von Kontrast und Rauschen. Der Unterabschnitt schließt mit einigen Überlegungen darüber, wie - und vor allem wie effizient - Detektoren kontinuierliche Elektronenwellen in diskrete Bereiche (Pixel) abtasten. Der folgende Unterabschnitt ist der Erfassung und Verarbeitung tomografischer Daten gewidmet. Hier gebe ich eine vereinfachte Beschreibung, wie Kippserien mit dem Mikroskop erfasst werden und wie die Rohdaten zu einer dreidimensionalen Darstellung der Probe verarbeitet werden. Der Einfluss der Neigungsgeometrie und der Dosisverteilung auf die Rekonstruktionsqualität wird ebenfalls diskutiert. Der zweite Teil des Unterabschnitts befasst sich mit der Strukturbestimmung durch Subtomogramm-Mittelung und der Errechnung der Auflösung von Kryo-EM-Rekonstruktion. Zuletzt schließe ich das Kapitel mit einer Beschreibung der Vorbereitung biologischer Proben für die Kryo-EM-Bildgebung mit einigen abschließenden Bemerkungen zur Dynamik und den Grenzen der Vitrifizierung ab. Kapitel zwei folgt dem Thema der Kryo-Präparation biologischer Proben mit der Untersuchung der Denaturierung von Proteinen an der Luft-Wasser-Grenzfläche. Im Einführungsabschnitt skizziere ich die wichtigsten Aspekte dieses Phänomens. Frühe Experimente zum Verhalten von Proteinen in Lösung zeigten ihre Neigung, aus der Lösung zu ihrer Grenzfläche mit der Atmosphäre zu diffundieren. Hier bilden sie meist unlösliche Schichten denaturierter Fibrillen Es wurde vorgeschlagen, dass die Korrelation zwischen Proteindenaturierung und Kontakt mit der Grenzfläche auf einen allmählichen Entfaltungsprozess zurückzuführen ist, bei dem Tausende von Wechselwirkungen pro Sekunde zu einer immer größeren strukturellen Schädigung führen würden. Ein direkter Beweis für diesen Mechanismus wurde jedoch nie dokumentiert. Um einen tieferen Einblick in die Dynamik an der Luft-Wasser-Grenzfläche zu erhalten, sammelte ich Kryotomogramme vitrifizierter Präparate der Fettsäuresynthase (FAS, Fatty Acid Synthase) aus Hefe. Im ersten Unterabschnitt der Ergebnisse beschreibe ich, wie die biochemische und Negativkontrastierung-TEM-Analyse von FAS-Fraktionen zeigte, dass der Komplex während des gesamten Reinigungsverfahrens intakt und katalytisch aktiv blieb. Nach der Vitrifizierung ergab die Einzelpartikelanalyse jedoch, dass 90% aller Komplexe stark beschädigt waren. Die tomographische Rekonstruktion derselben Proben zeigte, dass alle FAS-Komplexe an die Luft-Wasser-Grenzfläche gebunden waren. Die Seite des Moleküls, die der Grenzfläche ausgesetzt war, schien abgeflacht zu sein, während die Seite, in der wässrigen Phase, ihre native Struktur beibehielt. Die Mittelung der Subtomogramme bestätigte, dass eine Seite von fast 90% der Partikel stark beschädigt war. Durch den Vergleich der Ausrichtung dieser beschädigten Seite mit der Position eines Rechenmodells der Luft-Wasser-Grenzfläche konnte ich nachweisen, dass sie perfekt übereinstimmen, was den ersten direkten Beweis dafür liefert, dass die Wechselwirkung mit der Luft-Wasser-Grenzfläche die lokale Denaturierung großer Proteinkomplexe herbeiführt. ...

Charakterisierung des Lipidbindungsverhaltens und der Proteinfaltung von HCV NS5A unter Einfluss des NS5A-Inhibitors Daclatasvir

Mit 71 Millionen chronisch erkrankten Patienten im Jahr 2015 stellt die chronische Hepatitis C-Virusinfektion eine wichtige Ursache für Zirrhose, Leberdekompensation und Leberkrebs dar. Eine grundlegende Eigenschaft des Hepatitis C-Virus (HCV) ist die Biogenese modifizierter intrazellulärer Membranen. Das dabei aus dem endoplasmatischen Reticulum (ER) gebildete, sogenannte membranöse Netz (MW, membranous web) dient im Rahmen des HCV-Lebenszyklus als Gerüst für die Assemblierung eines Multi-Protein-Replikase-Komplexes. Das MW wird durch virale nicht-strukturelle Proteine wie NS5A induziert. Das Multidomänen-Metalloprotein NS5A ist über seine verschiedenen Domänen sowohl bei der Replikation am MW als auch bei der viralen Assemblierung und Freisetzung in der Nähe von Lipidtropfen (LD, lipid droplet) maßgeblich beteiligt. Seine N-terminale amphipathische Helix (AH) spielt dabei über die vermittelte Assoziation von NS5A mit Membranen eine wichtige Rolle. Damit verbundene spezifische Lipidinteraktionen von NS5A unterliegen molekularen Umstrukturierungen, die benötigt werden, um NS5A für seine verschiedenen Aufgaben im viralen Lebenszyklus anzupassen. Es liegen zwar Röntgen-strukturmodelle von Domäne 1-Dimeren und NMR-Strukturen zur AH vor, allerdings keine experimentellen Strukturen des NS5A-Proteins vollständiger Länge (NS5A fl) in seinem natürlichen Lipidmilieu. Trotz der essentiellen Bedeutung von NS5A für den HCV-Lebens-zyklus und langjähriger Forschung ist bisher nur wenig zur molekularen Funktionsweise von NS5A bekannt. Dennoch konnten durch Screening hochpotente NS5A-Inhibitoren entdeckt und weiterentwickelt werden. NS5A-Inhibitoren tragen als direkt wirkende antivirale Arzneimittel(DAA, direct-acting antiviral) entscheidend zum Therapieerfolg bei der Behandlung der Hepatitis C bei. Trotz ihrer Bedeutung in der Therapie und intensiver Forschung ist der Wirk-mechanismus von NS5A-Inhibitoren bisher ungeklärt. Eine durch NS5A-Inhibitoren induzierte intrazelluläre Umverteilung von NS5A und das ausschließliche Auftreten von Resistenz-assoziierten Mutationen (RAM) nahe der NS5A-Lipid-Interaktionsbereiche weisen jedoch auf einen Effekt der Inhibitoren auf die Lipid-NS5A-Interaktion hin. Als grundlegende Hypothese dieser Arbeit wurde somit vermutet, dass abhängig vom NS5A umgebenden Lipidmilieu (MW oder LD) spezifische Lipid-Protein-Interaktionen Einfluss auf die Struktur und Funktion von NS5A nehmen und NS5A-Inhibitoren über eine Inhibition dieser Interaktionen wirken. Polyphosphoinositide (PPI) könnten dabei als Lipidinteraktionspartner eine besondere Rolle spielen, da sie bedeutend für die Membran-Kennzeichnung verschiedener Zellkompartimente sind und auch die Funktion von Membranproteinen regulieren können. Eine Interaktion von NS5A mit PtdIns(4,5)P2 wurde bereits publiziert. Um basierend auf der postulierten Hypothese die mechanistischen Details im Wechselspiel von NS5A und intrazellulären Membranen sowie den dabei möglichen Effekt von NS5A-Inhibitoren zu untersuchen, musste zunächst NS5A in ausreichender Menge, Reinheit und Qualität rekombinant hergestellt werden. Hierfür wurde ein entsprechendes Protokoll zur Proteinexpression durch Baculovirus-vermittelte Expression in Sf9-Insektenzellen und Strep-Tactin-Reinigung für das full length Protein und trunkierte Varianten etabliert. In Kooperation mit einem Partner konnte unter Verwendung von giant unilamellar vesicles (GUVs) und konfokaler Mikroskopie gezeigt werden, dass unser full length Protein die Struktur von Membranen verändert (Membran-Remodellierung). Die Stabilität des gereinigten Proteins und damit Effekte auf die Proteinfaltung wurden mittels Thermal shift assay (TSA) untersucht und dabei auch Effekte des NS5A-Inhibitors Daclatasvir (DCV) und des Metall-Chelators EDTA überprüft. Die Bindung des Inhibitors hatte einen stabilisierenden Effekt auf die Proteinstruktur zur Folge. Potentielle Interaktionsmuster mit Membranlipiden wurden mit Hilfe eines Protein lipid overlay assays (PLOA) detektiert. Zusätzlich zum in der Literatur bereits beschriebenen Interaktionspartner PtdIns(4,5)P2 konnten weitere Lipid-Bindungspartner für NS5A identifiziert werden. Dabei legen die gewonnenen Daten nahe, dass die Interaktion über die Domäne 1 von NS5A vermittelt wird, wobei die Domänen 2 und 3 die Affinität zu den Lipidbindungspartnern erhöht, aber nicht das Phospholipid-Bindungsmuster verändert. DCV hatte im PLOA keine qualitativen Auswirkungen auf das Lipid-Bindungsmuster. Die Lipidinteraktionen wurden mittels eines Liposomen-Rekonstitutionsmodells validiert. In silico konnten basierend auf verfügbaren, experimentellen Strukturdaten und einem dynamischen Modell drei Cluster basischer Aminosäuren in NS5A-D1-AH als mögliche PPI-Bindungsstellen identifiziert werden. Basierend auf dem Strukturmodell wurde eine Mutationsstrategie zur Charakterisierung der potentiellen PPI-Bindungsstellen entwickelt. Aufbauend auf den Ergebnissen des PLOAs und der etablierten Liposomen-Rekonstitution von NS5A sollen über die Promotion hinaus NS5A-Interaktionen in artifiziellen Membran-systemen charakterisiert werden. Dabei soll durch gezielte Veränderung der Lipidzusammen-setzung und/oder Proteinvarianten mit gezielten Mutationen die Interaktion mit subzellulären Kompartimenten und potentielle Struktur-Funktionszusammenhänge in NS5A aufgeklärt werden. Die auf diese Arbeit aufbauenden weiterführenden Untersuchungen sollen dabei helfen, die mechanistischen Details der Lipidinteraktion von NS5A besser zu verstehen und auf diese Weise essentielle Prinzipien der Replikation von HCV und verwandter RNA-Viren aufzuklären. Außerdem soll der Wirkmechanismus von NS5A-Inhibitoren charakterisiert werden.