Введение. Спорадическая ретинобластома развивается в результате мутаций de novo в обоих аллелях гена RB1 в клетках сетчатки глаза. При спорадической ретинобластоме первоначальная мутация в гене RB1 нередко является мозаичной, то есть образуется в постзиготической ранней эмбриональной клетке, что приводит к неравномерному распределению мутантных клонов между различными тканями организма. Возможность идентифицировать мозаичный вариант мутации в гене RB1 имеет значение как для медико-генетического консультирования, так и для клинического ведения пациентов, поскольку мозаицизм влияет на развитие клинической картины заболевания, риск развития опухоли в другом глазу и других опухолей и на риск передачи мутации следующему поколению. Цель: установить частоту и спектр постзиготических мозаичных мутаций в гене RB1 в выборке больных со спорадической ретинобластомой, определить содержание мутантного аллеля в образцах с мозаицизмом. Метод. Исследование проведено на материале ДНК лимфоцитов крови больных со спорадической ретинобластомой. Скрининг точковых мутаций, малых инсерций/делеций в гене RВ1 осуществляли методом полупроводникового высокопроизводительного параллельного секвенирования (ВПС). Исключение протяженных делеций в гене RВ1 проводили методом MLPA. Для поиска мозаичных мутаций с очень низким содержанием (менее 10%) мутантного аллеля был разработан и проведен углубленный анализ данных ВПС, основанный на биоинформатических и статистических подходах. Для верификации выявленных мозаичных патогенных мутаций использовали секвенирование ДНК по Сэнгеру. Результаты. В исследованной выборке больных со спорадической унилатеральной формой ретинобластомы мозаичные мутации встречаются чаще, чем при спорадической билатеральной форме; различия статистически достоверны. В то же время, частоты мозаичных мутаций с высокой и низкой представленностью мутантных аллелей между группами больных с унилатеральной и билатеральной ретинобластомой достоверно не различаются. Все мозаичные мутации, представлены нуль-аллелями; мозаичных миссенс-мутаций в нашей выборке не обнаружено. Не выявлено мозаичных мутаций в 1-м и 2-м экзонах гена RB1, расположенных проксимальнее альтернативного промотора, импринтинг которого определяет пенетрантность мутаций в зависимости от родительского происхождения мутантного аллеля. Заключение. Применение глубокого ВПС в сочетании с усовершенствованным алгоритмом анализа результатов, направленным на выявление мозаичных мутаций, повышает эффективность ДНК-диагностики ретинобластомы, способствуя совершенствованию медико-генетического консультирования и лечения больных.
Background. Sporadic retinoblastoma develops as a result of de novo mutations in both alleles of the RB1 gene. Often in sporadic retinoblastoma, the initial mutation in RB1 is mosaic, that is, it is formed in a postzygotic, early embryonic cell, which leads to an uneven distribution of mutant clones between different tissues of the body. The ability to identify a mosaic variant of a mutation in the RB1 gene is important for both medical genetic counseling and clinical management of patients, since mosaicism affects the development of the clinical picture of the disease, the risk of developing a tumor in the other eye, as well as other tumors, and the risk of mutation transmission to the next generation. Aim: to establish the frequency and spectrum of somatic mosaic mutations in the RB1 gene in patients with sporadic retinoblastoma and to quantify the content of the mutant allele in cases with mosaicism. Methods. The study was carried out on the DNA of blood lymphocytes from patients with sporadic retinoblastoma. Screening of point mutations, small insertions/deletions in the RB1 gene was performed by semiconductor high-throughput parallel sequencing (NGS). Exclusion of gross deletions in the RB1 gene was performed by MLPA. To search for mosaic mutations with a very low representation (less than 10%) of the mutant allele, an in-depth analysis of the NGS data was developed an in-house algorithm based on bioinformatic and statistical approaches. To verify mosaic pathogenic mutations identified with NGS, Sanger sequencing was used. Results. Mosaic mutations were found more common among patients with sporadic unilateral form of retinoblastoma than in those with sporadic bilateral form; the differences are statistically significant. At the same time, the frequencies of mosaic mutations with a high and low representation of mutant alleles between the groups of patients with unilateral and bilateral retinoblastoma did not differ significantly. All mosaic mutations are null alleles; mosaic missense mutations were not found in our patients’ cohort. No mosaic mutations were detected in the 1st and 2nd exons of the RB1 gene, located proximal to the alternative promoter, the imprinting of which determines the penetrance of mutations depending on the parental origin of the mutant allele. Conclusion. The use of deep high-throughput parallel sequencing in combination with an improved algorithm for analyzing the NGS results, aimed at identifying mosaic mutations, increases the efficiency of DNA diagnostics of retinoblastoma, contributing to the improvement of medical genetic counseling and treatment of patients.
RB1 gene mutations in Argentine retinoblastoma patients. Implications for genetic counseling