Μελέτη της τοξικής, κυτταροτοξικής και γενοτοξικής δράσης νεοσυντιθέμενων ενώσεων και νανοϋλικών σε in vitro συνθήκες

2021 ◽  
Author(s):  
Ιωάννα Ευθυμίου
Keyword(s):  
Humic Acid ◽  
Vibrio Fischeri ◽  
Anodic Stripping Voltammetry ◽  
Micronucleus Assay ◽  
Stripping Voltammetry ◽  
Neutral Red ◽  
Flame Spray ◽  
Ag Nps ◽  
Zno Nps

Η συνεχώς αυξανόμενη παραγωγή προϊόντων της Nανοτεχνολογίας εγείρει στις μέρες μας σημαντικά ερωτήματα σχετικά με τον περιβαλλοντικό αντίκτυπό τους. Συγκεκριμένα, νανοσωματίδια (Nanoparticles, NPs) όπως το οξείδιο του ψευδαργύρου (ZnO) και αργύρου (Ag), παρουσιάζουν ευρεία εξάπλωση και εφαρμογή, γεγονός που αυξάνει τις πιθανότητες να βρεθούν βιοδιαθέσιμα στο περιβάλλον. Παρόλο που υπάρχει εκτεταμένη βιβλιογραφία αναφορικά με τα προαναφερθέντα NPs, συνήθως κάθε μελέτη εστιάζει σε συγκεκριμένο παράγοντα κάθε φορά όπως για παράδειγμα στη σύνθεση των NPs, τα βελτιωμένα χαρακτηριστικά τους, τις πιθανές εφαρμογές τους ή τις τοξικές τους επιδράσεις σε συγκεκριμένο οργανισμό ή κυτταρική σειρά. Αν και κάθε έρευνα ενισχύει το μέχρι τώρα γνωσιακό υπόβαθρο και συμπληρώνει κενά αναφορικά με τη Νανοτεχνολογία, με την παρούσα μελέτη έγινε η προσπάθεια πραγματοποίησης μιας ολοκληρωμένης εργασίας. Συγκεκριμένα, το ερευνητικό πλάνο περιλαμβάνει (α) τη σύνθεση των ZnO, Ag και ZnO-Ag NPs, (β) το χαρακτηρισμό τους (μεμονωμένα και σε διασπορά μέσα σε υδατικά διαλύματα), (γ) την αξιολόγηση των πιθανών τοξικών, κυτταροτοξικών και γενοτοξικών τους επιδράσεων σε διαφορετικά βιολογικά συστήματα (ανθρώπινα λεμφοκύτταρα, βακτήρια και αιμοκύτταρα δίθυρου μαλακίου) σε in vitro συνθήκες, (δ) τη μελέτη της αλληλεπίδρασης των εξεταζόμενων NPs παρουσία χουμικών οξέων (Humic Acids, HAs), προσομοιάζοντας έτσι τις πραγματικές περιβαλλοντικές συνθήκες. Αναλυτικότερα, τα NPs (ZnO, Ag και ZnO-Ag NPs) παρασκευάστηκαν με την καινοτόμο τεχνική πυρόλυσης ψεκασμού φλόγας (Flame Spray Pyrolysis, FSP) που χρησιμοποιείται για τη σύνθεση μεμονωμένων και σύνθετων NPs με υψηλή καθαρότητα και βελτιωμένα μορφολογικά και φυσικοχημικά χαρακτηριστικά. Ακολούθησε χαρακτηρισμός των NPs με περίθλαση ακτίνων Χ (powder X ray Diffraction, pXRD), με ηλεκτρονική μικροσκοπία διέλευσης (Transmission Electron Microscopy, TEM) και με δυναμική σκέδαση φωτός (Dynamic Light Scattering, DLS). Στη συνέχεια, διερευνήθηκε η ενδεχόμενη γενοτοξική και κυτταροτοξική δράση των NPs παρουσία και απουσία δύο χαρακτηρισμένων HAs (Humic acid-like-polycondensate, HALP; Leonardite Humic Acid, LHA) σε ανθρώπινα λεμφοκύτταρα με την εφαρμογή της τεχνικής των μικροπυρήνων με χρήση της κυτταροχαλασίνης-Β (Cytokinesis Block Micronucleus assay, CBMN assay). Η έκπλυση ιόντων Zn2+ προσδιορίστηκε στα ιζήματα των λεμφοκυττάρων που προέκυψαν από την τεχνική CBMN, μέσω της ανοδικής αναδιαλυτικής βολταμμετρίας (Anodic Stripping Voltammetry, ASV). Έπειτα, οι τοξικές επιδράσεις των NPs παρουσία και απουσία των δύο HAs μελετήθηκαν στο βακτήριο Vibrio fischeri με τη χρήση του συστήματος Microtox. Τέλος, εξετάστηκαν οι κυτταροτοξικές και οξειδωτικές επιδράσεις των NPs σε αιμοκύτταρα του μυδιού Mytilus galloprovincialis, μέσω προσδιορισμού (α) της λυσοσωμικής αποσταθεροποίησης (Τεχνική ουδέτερου ερυθρού/Neutral Red Retention Time), (β) της παραγωγής σουπεροξειδικών ανιόντων, (γ) της παραγωγής οξειδίων του αζώτου (υπό μορφή νιτρωδών) και (δ) των επιπέδων λιπιδικής υπεροξείδωσης. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα, στην περίπτωση της τεχνικής CBMN, δεν υπήρξε εκδήλωση γενοτοξικών φαινομένων σε καμία περίπτωση, για κανένα από τα υπό μελέτη NPs τόσο παρουσία όσο και απουσία των δύο HAs. Από την άλλη πλευρά, όλα τα NPs εκδήλωσαν κυτταροτοξική δράση. Ωστόσο, αν και τα Ag και ZnO-Ag NPs οδήγησαν σε επαγωγή κυτταροτοξικότητας παρουσία και απουσία των δύο HAs, τα μίγματα των ZnO NPs με τα δύο HAs ελάττωσαν την κυτταροτοξικότητα που προκλήθηκε από τα μεμονωμένα ZnO NPs. Αναφορικά με τα ποσοστά έκπλυσης ιόντων Zn2+, παρατηρήθηκε ότι οι μεγαλύτερες συγκεντρώσεις των μιγμάτων (ZnO, ZnO-Ag)NPs-HAs διατήρησαν ένα μικρό ποσοστό ιόντων, ενώ στις υπόλοιπες περιπτώσεις το ποσοστό ήταν αμελητέο. Στην περίπτωση προσδιορισμού της τοξικότητας των NPs έναντι του βακτηρίου Vibrio fischeri, διαπιστώθηκε ενισχυμένη τοξικότητα των ZnO και ZnO-Ag NPs ενώ τα Ag NPs εμφάνισαν τη μικρότερη τοξική δράση. Ο συνδυασμός με τα δύο HAs δεν οδήγησε σε κάποια σημαντική αλλαγή της τοξικότητας σε σύγκριση με τα μεμονωμένα NPs, στην περίπτωση των ZnO και ZnO-Ag NPs. Αντιθέτως, τα μίγματα Ag NPs-HAs ελάττωσαν την τοξικότητα που προκλήθηκε από τα μεμονωμένα Ag NPs. Όσον αφορά τις επιδράσεις των NPs στα αιμοκύτταρα των μυδιών, διαπιστώθηκε ότι κάθε NP διέθετε διαφορετικό μηχανισμό εκδήλωσης τοξικότητας. Συγκεκριμένα, τα ZnO NPs - μέσω του επιφανειακού τους φορτίου και της σωματιδιακής συσσωμάτωσης - ενδέχεται να εισέλθουν στα κύτταρα πριν την εκδήλωση κυτταρικής θνησιμότητας, ενώ η απελευθέρωση των ιόντων Zn2+ μπορούσε να οδηγήσει στην παραγωγή ριζών μέσω διέγερσης της διαδικασίας της αναπνευστικής έκρηξης. Αντιθέτως, η παρατηρούμενη κυτταρική και οξειδωτική καταπόνηση που προκλήθηκε από τα Ag NPs, πιθανότατα λόγω της απελευθέρωσης ιόντων Ag+, δε φάνηκε να σχετίζεται με την αναπνευστική έκρηξη. Ομοίως, οι κυτταρικές και οξειδωτικές βλάβες που προκλήθηκαν από τα ZnO-Ag NPs, υπέδειξαν την παρουσία ανταγωνιστικής/συνεργιστικής δράσης μεταξύ των μεταλλικών ιόντων (Zn2+, Ag+) που ανάλογα με τις εκάστοτε συνθήκες μπορούν να ρυθμίσουν τη συμπεριφορά και τις βιολογικές επιδράσεις του σύνθετου NP. Συμπερασματικά, τα αποτελέσματα υποδεικνύουν τη δυνατότητα των νεοσυντιθέμενων ZnO, Ag και ZnO-Ag NPs να προκαλούν τοξικές, κυτταροτοξικές και οξειδωτικές επιδράσεις. Παρόλα αυτά, διαπιστώθηκε ότι οι επιδράσεις των NPs ποικίλουν τόσο μεταξύ των ίδιων των NPs, όσο και μεταξύ των τεχνικών και των οργανισμών μοντέλων και/ή κυττάρων που χρησιμοποιήθηκαν. Κατά συνέπεια, είναι εμφανές ότι είναι αναγκαίο να αξιολογείται το τοξικολογικό προφίλ των NPs με τη χρήση ενός εύρους τεχνικών, βιοδεικτών και περιβαλλοντικών σεναρίων, καθώς και να γίνεται παράλληλα ένας ολοκληρωμένος και αξιόπιστος χαρακτηρισμός αυτών σε κάθε περίπτωση.

scholarly journals Development of a Rapid Cell-free Method for Cytotoxicity Assessment of Vapor Phase of Cigarette Smoke

2011 ◽  
Vol 24 (4) ◽  
pp. 157-165
Author(s):  
X Cahours ◽  
M Blanchet ◽  
M Dubois ◽  
C Haond
Keyword(s):  
Cigarette Smoke ◽  
Vapor Phase ◽  
Screening Method ◽  
Micronucleus Assay ◽  
Neutral Red ◽  
Uptake Assay ◽  
Anti Oxidant ◽  
Cytotoxicity Assessment ◽  
Phosphate Buffered Saline

AbstractCurrently, several in vitro tests are widely used to measure toxicological properties of mainstream smoke (Neutral Red Uptake Assay, Micronucleus assay, Ames Test). These tests are necessary to assess cytotoxicity, genotoxicity, and mutagenicity, but are time consuming. This is essentially due to the preparation and the handling of cells. It is difficult to use these in vitro tests as screening method for product testing and development. For a better assessment of the cytotoxicity of the vapor phase, a rapid cell-free method has been developed. This paper describes a capillary electrophoresis cell-free method, based on the depletion of an anti-oxidant L-gamma-glutamyl-L-cysteinylglycine (GSH), applied to an aliquot of vapor phase phosphate buffered saline (PBS)-trapped cigarette smoke (as recommended for in vitro testing). The correlation between this method and the survival/viability test (Neutral Red cytotoxicity) is excellent (coefficient of correlation (r = 0.99)).

scholarly journals Strategies for Surface Modification with Ag-Shaped Nanoparticles: Electrocatalytic Enhancement of Screen-Printed Electrodes for the Detection of Heavy Metals

Sensors ◽  
2019 ◽  
Vol 19 (19) ◽  
pp. 4249 ◽  
Author(s):  
Karina Torres-Rivero ◽  
Lourdes Torralba-Cadena ◽  
Alexandra Espriu-Gascon ◽  
Ignasi Casas ◽  
Julio Bastos-Arrieta ◽  
...  
Keyword(s):  
Heavy Metals ◽  
Electrode Surface ◽  
Spin Coating ◽  
Anodic Stripping Voltammetry ◽  
Stripping Voltammetry ◽  
Ag Nps ◽  
Electrocatalytic Effect ◽  
Anodic Stripping ◽  
Screen Printed

Screen-printed carbon nanofiber electrodes (SPCNFEs) represent an alternative with great acceptance due to their results, as well as their low impact on the environment. In order to improve their performance, in the present work they were modified with silver nanoparticles (Ag-NPs) and electrochemically characterized by using anodic stripping voltammetry. From the Ag-NP synthesis, silver seeds (Ag-NS) and silver nanoprisms (Ag-NPr) were obtained. The Ag-NP formation was confirmed by micrographs, where Ag-NPs with diameters of 12.20 ± 0.04 nm for Ag-NS and 20.40 ± 0.09 nm for Ag-NPr were observed. The electrodes were modified by using three different deposition methods—drop-casting, spin-coating, and in situ approaches—that offer different nanoparticle distribution and electrode modification times. It was observed that the last methodology showed a low amount of Ag-NS deposited on the electrode surface and deep alteration of this surface. Those facts suggest that the in situ synthesis methodology was not appropriate for the determination of heavy metals, and it was discarded. The incorporation of the nanoparticles by spin-coating and drop-casting strategies showed different spatial distribution on the electrode surface, as proved by scanning electron microscopy. The electrodes modified by these strategies were evaluated for the cadmium(II) and lead(II) detection using differential pulse anodic stripping voltammetry, obtaining detection limit values of 2.1 and 2.8 µg·L−1, respectively. The overall results showed that the incorporation route does not directly change the electrocatalytic effect of the nanoparticles, but the shape of these nanoparticles (spherical for seeds and triangular for prisms) has preferential electrocatalytic enhancement over Cd(II) or Pb(II).

scholarly journals Hepato(Geno)Toxicity Assessment of Nanoparticles in a HepG2 Liver Spheroid Model

Nanomaterials ◽  
2020 ◽  
Vol 10 (3) ◽  
pp. 545 ◽  
Author(s):  
Elisabeth Elje ◽  
Espen Mariussen ◽  
Oscar H. Moriones ◽  
Neus G. Bastús ◽  
Victor Puntes ◽  
...  
Keyword(s):  
Laser Doppler Anemometry ◽  
Animal Experiments ◽  
Toxicity Assessment ◽  
In Vitro Models ◽  
Substantial Part ◽  
Ag Nps ◽  
Zno Nps ◽  
Vis Spectroscopy ◽  
Vitro Model

(1) In compliance with the 3Rs policy to reduce, refine and replace animal experiments, the development of advanced in vitro models is needed for nanotoxicity assessment. Cells cultivated in 3D resemble organ structures better than 2D cultures. This study aims to compare cytotoxic and genotoxic responses induced by titanium dioxide (TiO2), silver (Ag) and zinc oxide (ZnO) nanoparticles (NPs) in 2D monolayer and 3D spheroid cultures of HepG2 human liver cells. (2) NPs were characterized by electron microscopy, dynamic light scattering, laser Doppler anemometry, UV-vis spectroscopy and mass spectrometry. Cytotoxicity was investigated by the alamarBlue assay and confocal microscopy in HepG2 monolayer and spheroid cultures after 24 h of NP exposure. DNA damage (strand breaks and oxidized base lesions) was measured by the comet assay. (3) Ag-NPs were aggregated at 24 h, and a substantial part of the ZnO-NPs was dissolved in culture medium. Ag-NPs induced stronger cytotoxicity in 2D cultures (EC50 3.8 µg/cm2) than in 3D cultures (EC50 > 30 µg/cm2), and ZnO-NPs induced cytotoxicity to a similar extent in both models (EC50 10.1–16.2 µg/cm2). Ag- and ZnO-NPs showed a concentration-dependent genotoxic effect, but the effect was not statistically significant. TiO2-NPs showed no toxicity (EC50 > 75 µg/cm2). (4) This study shows that the HepG2 spheroid model is a promising advanced in vitro model for toxicity assessment of NPs.

scholarly journals Prediction of Skin Sensitization Potential of Silver and Zinc Oxide Nanoparticles Through the Human Cell Line Activation Test

2021 ◽  
Vol 3 ◽  
Author(s):  
Ravi Gautam ◽  
SuJeong Yang ◽  
Anju Maharjan ◽  
JiHun Jo ◽  
Manju Acharya ◽  
...  
Keyword(s):  
Zinc Oxide ◽  
Cell Line ◽  
Human Cell ◽  
Human Cell Line ◽  
Adverse Outcome Pathway ◽  
Skin Sensitization ◽  
Ag Nps ◽  
Zno Nps ◽  
Activation Test

The development of nanotechnology has propagated the use of nanoparticles (NPs) in various fields including industry, agriculture, engineering, cosmetics, or medicine. The use of nanoparticles in cosmetics and dermal-based products is increasing owing to their higher surface area and unique physiochemical properties. Silver (Ag) NPs' excellent broad-spectrum antibacterial property and zinc oxide (ZnO) NPs' ability to confer better ultraviolet (UV) protection has led to their maximal use in cosmetics and dermal products. While the consideration for use of nanoparticles is increasing, concerns have been raised regarding their potential negative impacts. Although used in various dermal products, Ag and ZnO NPs' skin sensitization (SS) potential has not been well-investigated using in vitro alternative test methods. The human Cell Line Activation Test (h-CLAT) that evaluates the ability of chemicals to upregulate the expression of CD86 and CD54 in THP-1 cell line was used to assess the skin sensitizing potential of these NPs. The h-CLAT assay was conducted following OECD TG 442E. NPs inducing relative fluorescence intensity of CD86 ≥ 150% and/or CD54 ≥ 200% in at least two out of three independent runs were predicted to be positive. Thus, Ag (20, 50, and 80 nm) NPs and ZnO NPs were all predicted to be positive in terms of SS possibility using the h-CLAT prediction model. Although further confirmatory tests addressing other key events (KEs) of SS adverse outcome pathway (AOP) should be carried out, this study gave an insight into the need for cautious use of Ag and ZnO NPs based skincare or dermal products owing to their probable skin sensitizing potency.

scholarly journals Μελέτη της βιολογικής δράσης διαφόρων φυτοφαρμάκων σε συνδυασμό με τη φυσικοχημική τους συμπεριφορά

2008 ◽  
Author(s):  
Πολυχρόνης Στιβακτάκης
Keyword(s):  
Micronucleus Assay ◽  
Stripping Voltammetry ◽  
Cathodic Stripping Voltammetry ◽  
Cathodic Stripping

Τα φυτοφάρμακα αποτελούν σημαντικούς περιβαλλοντικούς ρυπαντές, στους οποίους εκτίθεται καθημερινά ο άνθρωπος με συνεχώς αυξανόμενο ρυθμό. Ο άνθρωπος εκτίθεται στα φυτοφάρμακα είτε μέσω της επαγγελματικής του ενασχόλησης ως καλλιεργητής, κατά τη διάρκεια ψεκασμών, είτε ως καταναλωτής, μέσω των υπολειμμάτων που παραμένουν σε τρόφιμα, καπνό, αέρα, έδαφος, νερό, φυτά και ζώα. Σκοπός της διατριβής είναι η μελέτη της βιολογικής δράσης φυτοφαρμάκων σε συνδυασμό με τη φυσικοχημική τους συμπεριφορά. Ειδικότερα επιδιώκεται να διερευνηθεί αν η γενοτοξική δράση τους καθορίζεται από τις φυσικοχημικές τους ιδιότητες και κατ’ επέκταση από τις περιβαλλοντικές συνθήκες. Επιλέχτηκαν δύο φυτοφάρμακα ευρείας χρήσης, το Methidathion και το Imidacloprid. Το Methidathion είναι οργανοφωσφορικό εντομοκτόνο, που δρα σαν ανταγωνιστής της χολινεστεράσης. To Imidacloprid είναι χλωρο-νικοτινικό εντομοκτόνο ευρέως φάσματος, το οποίο δρα ως ανταγωνιστής της ακετυλοχολίνης και ανήκει στα νικοτινοειδή, μια νέα κατηγορία φυτοφαρμάκων. Για την εκτίμηση της γενοτοξικής δράσης των παραπάνω φυτοφαρμάκων επιλέχθηκε η τεχνική των μικροπυρήνων (Micronucleus Assay) σε ανθρώπινα λεμφοκύτταρα in vitro με τη χρήση κυτταροχαλασίνης-Β. Για τη μελέτη της φυσικοχημικής συμπεριφοράς καθώς και της παρουσίας τους στον εσωκυττάριο ή εξωκυττάριο χώρο εφαρμόστηκε η τεχνική της καθοδικής βολταμετρίας με προσυγκέντρωση (Cathodic Stripping Voltammetry). Επίσης, πραγματοποιήθηκε in vivo μελέτη σε ομάδα αγροτών του νομού Ηρακλείου που χρησιμοποιούσαν μεταξύ άλλων φυτοφαρμάκων και το Methidathion. Συγχρόνως μελετήθηκε in vivo η δράση του Imidacloprid σε επίμυες. Τα αποτελέσματα των πειραμάτων για το Methidathion έδειξαν ότι ο περιβαλλοντικός παράγοντας pH, επηρεάζει καταλυτικά τη δομή του, ενισχύοντας την επικινδυνότητά του. Τα in vitro πειράματα προσδιορισμού της γενοτοξικής δράσης του Imidacloprid με την τεχνική των μικροπυρήνων σε καλλιέργειες ανθρώπινων λεμφοκυττάρων σε συνδυασμό με την τεχνική της καθοδικής βολταμετρίας με προσυγκέντρωση, παρουσία και απουσία ΚΝΟ₃, έδειξαν μεταβολή της φυσικοχημικής συμπεριφοράς του φυτοφαρμάκου εξαιτίας της παρουσίας του ΚΝΟ₃. Ο παράγοντας που επηρεάζει τη δράση του Imidacloprid είναι το φορτίο του μορίου το οποίο το κρατά προσκολλημένο στη μεμβράνη του λεμφοκυττάρου και δεν το αφήνει να εισχωρήσει στο εσωτερικό. Παρουσία ΚΝΟ₃ , το φορτίο του Imidacloprid εξουδετερώνεται με αποτέλεσμα να εισχωρεί ελεύθερα στο εσωτερικό του κυττάρου. Τα παραπάνω πειράματα έδειξαν ότι η παρουσία μιας ακίνδυνης και άφθονης στη φύση ένωσης, όπως το ΚΝΟ₃ μπορεί να αλλάξει δραματικά τον τρόπο δράσης ενός φυτοφαρμάκου όπως το Imidacloprid και να το μετατρέψει από φιλικό προς τον άνθρωπο σε αρκετά επικίνδυνο. Επίσης, από την μελέτη της θερμοδυναμικής συμπεριφοράς του Imidacloprid με την χρήση της καθοδικής βολταμετρίας με προσυγκέντρωση, προέκυψε ότι το συγκεκριμένο φυτοφάρμακο παρουσιάζει μεγαλύτερη δραστικότητα σε χαμηλές θερμοκρασίες γεγονός που το καθιστά πιο επικίνδυνο για τους ψυχρόαιμους οργανισμούς (έντομα) και λιγότερο για τους θερμόαιμους (θηλαστικά). Η εργασία αυτή συνεισφέρει στην αποσαφήνιση του μηχανισμού δράσης των δύο αυτών φυτοφαρμάκων. Τα αποτελέσματα αυτά που προέκυψαν, τόσο βιολογικά όσα και φυσικοχημικά, δείχνουν ότι η διεπιστημονική προσέγγιση μπορεί να δώσει χρήσιμες απαντήσεις σε ζητήματα περιβαλλοντικού ενδιαφέροντος.

Sign in / Sign up

Export Citation Format

Share Document