Актуальность. Нейрофиброматоз первого типа является одним из наиболее распространенных моногенных заболеваний. Этиологическим фактором его развития является патогенная мутация в гене NF1. Однако у части пациентов не удается достичь молекулярно-генетического подтверждения клинического диагноза. Мы полагаем, что в некоторых случаях это может быть обусловлено соматическим мозаицизмом с малой долей клеток, несущих патогенный аллель, в анализируемом образце биологического материала. Аллели с низкой представленностью отсеиваются общепринятыми фильтрами программного обеспечения при поиске генетических вариантов методом высокопроизводительного параллельного секвенирования (ВПС) и/или не детектируются визуально за счет слияния с фоновым шумом при анализе результатов секвенирования по Сэнгеру. Цель. Поиск патогенных мозаичных генетических вариантов у пациентов с нейрофиброматозом первого типа без выявленных стандартными методами герминальных мутаций в гене NF1. Материалы и методы. Исследование проведено на материале ДНК лимфоцитов периферической крови 275 пациентов, объединенных клиническим диагнозом нейрофиброматоз первого типа и отсутствием герминальных мутаций в генах NF1 и NF2 по результатам стандартных лабораторных исследований. Поиск точковых мутаций осуществляли методом ВПС на платформе Ion Torrent. Дизайн панели праймеров включал экзоны, прилегающие к ним интронные сегменты (20-70 п.н.), а также 3’UTR и 5’UTR генов NF1 и NF2. Исключение протяженных делеций в NF1 и NF2 осуществляли методом MLPA. С целью поиска мозаичных генетических вариантов был разработан и проведен углубленный анализ данных ВПС, основанный на биоинформатических и статистических подходах. Для верификации выявленных мозаичных патогенных генетических вариантов использовали секвенирование ДНК по Сэнгеру и гетеродуплексный анализ. Результаты. Патогенные соматические мутации в гене NF1 выявлены в 12 из 275 образцов (4,4%) ДНК больных, у которых были исключены герминальные мутации. В 8 образцах наличие мутантного аллеля было подтверждено альтернативными методами. Выводы. ДНК-диагностика доминантно наследуемых заболеваний требует особых подходов, учитывающих явление соматического мозаицизма. Предложенный метод позволяет выявить генетические варианты, представленные с малой аллельной частотой, без увеличения глубины секвенирования исследуемого образца и может быть применен для ретроспективного анализа данных ВПС с целью повышения качества ДНК-диагностики.
Background. Neurofibromatosis type 1 is one of the most common monogenic disorders. A pathogenic mutation in NF1 is the etiological factor of neurofibromatosis type 1. Nevertheless, not all patients receive molecular genetic verification of the clinical diagnosis. We believe that this may be due to a somatic mosaicism with a small fraction of pathogenic allele, which is neglected by the NGS analysis software and/or is undetectable by Sanger sequencing due to noisy background. Objective. To detect pathogenic mosaic mutations in cases of neurofibromatosis type 1 without germline genetic variants. Material and methods. Two hundred seventy five peripheral blood lymphocyte DNA samples from patients with NF1 and without germline mutation were retrospectively analyzed. DNA samples were sequenced with Ion PGM and Ion S5 NGS systems. Gene panel design included NF1 and NF2 genes: exons, adjacent intron segments (20-70 b.p.), 3’UTRs and 5’UTRs. Samples were also tested using MLPA in order to exclude deletions in NF1 and NF2. We developed and implemented the pipeline to search mosaic cases using bioinformatics approaches. All newly detected mutations were evaluated by Sanger sequencing and by heteroduplex analysis. Result. We have identified new pathogenic mutations in NF1 for 12 patients (4.4%) and verified 8 of them using alternative methods. Conclusion. Dominant disorders, like neurofibromatosis type 1, require a detailed bioinformatic analysis of NGS results with respect to somatic mosaicism. Our approach makes it possible to identify genetic variants with low representation of a pathogenic allele without increasing the sequencing depth of the sample under study and can be used for retrospective analysis of NGS data in order to improve the quality of DNA diagnostics.
The utility of molecular genetic techniques in craniosynostosis cases associated with intellectual disability
